Белок Paip2 Drosophila melanogaster связывается с белком ENY2 и взаимодействует с комплексом TREX-2 В составе мРНП-частиц гистонов

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Белок ENY2 – эволюционно консервативный мультифункциональный белок, входящий в состав нескольких комплексов, регулирующих различные этапы экспрессии генов. ENY2 входит в состав комплекса TREX-2, необходимого для экспорта большей части мРНК из ядра в цитоплазму через ядерные поры у многих эукариот. Широкий спектр функций ENY2 позволяет предположить, что он может ассоциироваться и с другими белковыми факторами или комплексами. С целью поиска белков, взаимодействующих с ENY2, проведен скрининг кДНК-библиотеки в дрожжевой двугибридной системе. В результате найдено взаимодействие ENY2 c РНК-связывающим белком Paip2. Paip2 непосредственно связывается с ENY2 in vitro и взаимодействует с ENY2 in vivo на молекулярном и генетическом уровне. Paip2 способен ассоциировать с ENY2-содержащим комплексом TREX-2. Paip2 присутствует в локусе кластера генов гистонов, Paip2 и ENY2 совместно обнаружены в тельцах гистонового локуса (histone locus body, HLB) – ядерных структурах, в которых происходит скоординированная транскрипция и процессинг мРНК гистонов. Paip2 вместе с ENY2 и другими белками комплекса TREX-2 ассоциирован с матричными рибонуклеопротеиновыми частицами (мРНП-частицами) гистонов. Нокдаун мРНК Paip2 приводит к уменьшению связывания субъединиц TREX-2 с мРНК гистонов. Таким образом, Paip2 можно считать новым белком-партнером ENY2 в составе комплекса TREX-2, который участвует в связывании TREX-2 с мРНП-частицами гистонов.

Сокращения: AD (activator domain) – активаторный домен; BD (DNA-binding domain) – ДНК-связывающий домен; СВР (cap-binding proteins) – кэпсвязывающие белки; CPRG (chlorophenol red-β-D-galactopyranoside) – хлорфеноло красный-β-D-галактопиранозид; DUB-модуль (deubiquitinilation module) – деубиквитинирующий модуль; HLB (histone locus body) – тельца гистонового локуса; ORC (origin replication complex) – комплекс инициации репликации; PABP (poly(A)-binding protein) – поли(А)-связывающий белок; RIP (RNA immunoprecipitation) – иммунопреципитация РНП-частиц; мРНП частица – мРНК-содержащая рибонуклеопротеиновая частица; S2 TЛ – тотальный лизат S2-клеток; ЯЭ – ядерный эмбриональный экстракт.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

М. М. Куршакова

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Email: kursha@mail.ru
Россия, Москва, 119991

А. Н. Краснов

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: kursha@mail.ru
Россия, Москва, 119334

Е. Н. Набирочкина

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: kursha@mail.ru
Россия, Москва, 119334

С. Г. Георгиева

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: kursha@mail.ru
Россия, Москва, 119991

Список литературы

  1. Kopytova D.V., Krasnov A.N., Orlova A.V., Gurskiy D. Ya., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G., Shidlovskii Y.V. (2010) ENY2: couple, triple…more? Cell Cycle. 9, 479–481.
  2. Galán A., Rodríguez-Navarro S. (2012) Sus1/ENY2: a multitasking protein in eukaryotic gene expression. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 47, 556–568.
  3. Fischer T. (2002) The mRNA export machinery requires the novel Sac3p-Thp1p complex to dock at the nucleoplasmic entrance of the nuclear pores. EMBO J. 21, 5843–5852.
  4. Kurshakova M.M., Krasnov A.N., Kopytova D.V., Shidlovskii Y.V., Nikolenko J.V., Nabirochkina E.N., Spehner D., Schultz P., Tora L., Georgieva S.G. (2007) SAGA and a novel Drosophila export complex anchor efficient transcription and mRNA export to NPC. EMBO J. 26, 4956–4965.
  5. Lu Q., Tang X., Tian G., Wang F., Liu K., Nguyen V., Kohalmi S.E., Keller W.A., Tsang E.W., Harada J.J., Rothstein S.J., Cui Y. (2009) Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin: TREX-2 mRNA export complex. Plant J. 61, 259–270.
  6. Jani D., Lutz S., Hurt E., Laskey R.A., Stewart M., Wickramasinghe V.O. (2012) Functional and structural characterization of the mammalian TREX-2 complex that links transcription with nuclear messenger RNA export. Nucleic Acids Res. 40, 4562–4573.
  7. Ellisdon A.M., Dimitrova L., Hurt E., Stewart M. (2012) Structural basis for the assembly and nucleic acid binding of the TREX-2 transcription-export complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 328–336.
  8. Wickramasinghe V.O., Stewart M., Laskey R.A. (2010) GANP enhances the efficiency of mRNA nuclear export in mammalian cells. Nucleus. 1, 393–396.
  9. Stewart M. (2019) Structure and function of the TREX-2 complex. Subcell. Biochem. 93, 461–470. doi: 10.1007/978-3-030-28151-9_15
  10. Kopytova D., Popova V., Kurshakova M., Shidlovskii Y., Nabirochkina E., Brechalov A., Georgiev G., Georgieva S. (2016) ORC interacts with THSC/TREX-2 and its subunits promote Nxf1 association with mRNP and mRNA export in Drosophila. Nucleic Acids Res. 44, 4920–4933.
  11. Zhao Y., Lang G., Ito S., Bonnet J., Metzger E., Sawatsubashi S., Suzuki E., Le Guezennec X., Stunnenberg H.G., Krasnov A., Georgieva S.G., Schüle R., Takeyama K., Kato S., Tora L., Devys D. (2008) A TFTC/STAGA module mediates histone H2A and H2B deubiquitination, coactivates nuclear receptors, and counteracts heterochromatin silencing. Mol. Cell. 29, 92–101.
  12. Pfab A., Bruckmann A., Nazet J., Merkl R., Grasser K.D. (2018) The adaptor protein ENY2 is a component of the deubiquitination module of the Arabidopsis SAGA transcriptional co-activator complex but not of the TREX-2 complex. J. Mol. Biol. 430, 1479–1494.
  13. Atanassov B.S., Mohan R.D., Lan X., Kuang X., Lu Y., Lin K., McIvor E., Li W., Zhang Y., Florens L., Byrum S.D., Mackintosh S.G., Calhoun-Davis T., Koutelou E., Wang L., Tang D.G., Tackett A.J., Washburn M.P., Workman J.L., Dent S.Y. (2016) ATXN7L3 and ENY2 coordinate activity of multiple H2B deubiquitinases important for cellular proliferation and tumor growth. Mol. Cell. 62, 558–571.
  14. Ellisdon A.M., Jani D., Köhler A., Hurt E., Stewart M. (2010) Structural basis for the interaction between yeast Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase (SAGA) complex components Sgf11 and Sus1. J. Biol. Chem. 285, 3850–3856.
  15. Galán A., García-Oliver E., Nuño-Cabanes C., Rubinstein L., Kupiec M., Rodríguez-Navarro S. (2018) The evolutionarily conserved factor Sus1/ENY2 plays a role in telomere length maintenance. Curr. Genet. 64, 635–644.
  16. Kopytova D.V., Orlova A.V., Krasnov A.N., Gurskiy D. Ya., Nikolenko J.V., Nabirochkina E.N., Shidlovskii Y.V., Georgieva S.G. (2010) Multifunctional factor ENY2 is associated with the THO complex and promotes its recruitment onto nascent mRNA. Genes Dev. 24, 86–96.
  17. Gurskiy D., Orlova A., Vorobyeva N., Nabirochkina E., Krasnov A., Shidlovskii Y., Georgieva S., Kopytova D. (2012) The DUBm subunit Sgf11 is required for mRNA export and interacts with Cbp80 in Drosophila. Nucleic Acids Res. 40, 10689–10700.
  18. Khaleghpour K., Svitkin Y.V., Craig A.W., DeMaria C.T., Deo R.C., Burley S.K., Sonenberg N. (2001) Translational repression by a novel partner of human poly(A) binding protein, Paip2. Mol. Cell. 7, 205–216.
  19. Kozlov G., De Crescenzo G., Lim N.S., Siddiqui N., Fantus D., Kahvejian A., Trempe J.F., Elias D., Ekiel I., Sonenberg N., OꞌConnor-McCourt M., Gehring K. (2004) Structural basis of ligand recognition by PABC, a highly specific peptide-binding domain found in poly(A)-binding protein and a HECT ubiquitin ligase. EMBO J. 23, 272–281.
  20. Khaleghpour K., Kahvejian A., De Crescenzo G., Roy G., Svitkin Y.V., Imataka H., OꞌConnor-McCourt M., Sonenberg N. (2001) Dual interactions of the translational repressor Paip2 with poly(A) binding protein. Mol. Cell. Biol. 21, 5200–5213.
  21. Karim M.M., Svitkin Y.V., Kahvejian A., De Crescenzo G., Costa-Mattioli M., Sonenberg N. (2006) A mechanism of translational repression by competition of Paip2 with eIF4G for poly(A) binding protein (PABP) binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 9494–9499.
  22. Ivanov A., Shuvalova E., Egorova T., Shuvalov A., Sokolova E., Bizyaev N., Shatsky I., Terenin I., Alkalaeva E. (2019) Polyadenylate-binding protein-interacting proteins PAIP1 and PAIP2 affect translation termination. J. Biol. Chem. 294, 8630–8639.
  23. Polacek C., Friebe P., Harris E. (2009) Poly(A)-binding protein binds to the non-polyadenylated 3′ untranslated region of dengue virus and modulates translation efficiency. J. Gen. Virol. 90, 687–692.
  24. Onesto C., Berra E., Grépin R., Pagès G. (2004) Poly(A)-binding protein-interacting protein 2, a strong regulator of vascular endothelial growth factor mRNA. J. Biol. Chem. 279, 34217–34226.
  25. Gouyon F., Onesto C., Dalet V., Pages G., Leturque A., Brot-Laroche E. (2003) Fructose modulates GLUT5 mRNA stability in differentiated Caco-2 cells: role of cAMP-signalling pathway and PABP (polyadenylated-binding protein)-interacting protein (Paip) 2. Biochem. J. 375, 167–174.
  26. Alvarez-Saavedra M., Antoun G., Yanagiya A., Oliva-Hernandez R., Cornejo-Palma D., Perez-Iratxeta C., Sonenberg N., Cheng H.-Y.M. (2011) miRNA-132 orchestrates chromatin remodeling and translational control of the circadian clock. Hum. Mol. Genet. 20, 731–751.
  27. Berlanga J.J., Baass A., Sonenberg N. (2006) Regulation of poly(A) binding protein function in translation: characterization of the Paip2 homolog, Paip2B. RNA. 12, 1556–1568.
  28. Roy G., Miron M., Khaleghpour K., Lasko P., Sonenberg N. (2004) The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol. Cell. Biol. 24, 1143–1154.
  29. Kachaev Z.M., Lebedeva L.A., Kozlov E.N., Toropygin I.Y., Schedl P., Shidlovskii Y.V. (2018) Paip2 is localized to active promoters and loaded onto nascent mRNA in Drosophila. Cell Cycle. 17, 1708–1720.
  30. Kachaev Z.M., Lebedeva L.A., Shaposhnikov A.V., Moresco J.J., Yates J.R., Schedl P., Shidlovskii Y.V. (2019) Paip2 cooperates with Cbp80 at an active promoter and participates in RNA polymerase II phosphorylation in Drosophila. FEBS Lett. 593, 1102–1112.
  31. Duronio R.J., Marzluff W.F. (2017) Coordinating cell cycle-regulated histone gene expression through assembly and function of the Histone Locus Body. RNA Biol. 14, 726–738.
  32. Georgieva S., Nabirochkina E., Dilworth F.J., Eickhoff H., Becker P., Tora L., Georgiev P., Soldatov A. (2001) The novel transcription factor e(y)2 interacts with TAFII40 and potentiates transcription activation on chromatin templates. Mol. Cell. Biol. 21, 5223–5231.
  33. Glukhova A.A., Kurshakova M.M., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G., Kopytova D.V. (2021) PCID2, a subunit of the Drosophila TREX-2 nuclear export complex, is essential for both mRNA nuclear export and its subsequent cytoplasmic trafficking. RNA Biol. 18, 1969–1980.
  34. MacAlpine D.M., Rodríguez H.K., Bell S.P. (2004) Coordination of replication and transcription along a Drosophila chromosome. Genes Dev. 18, 3094–3105.
  35. Platero J.S., Sharp E.J., Adler P.N., Eissenberg J.C. (1996) In vivo assay for protein-protein interactions using Drosophila chromosomes. Chromosoma. 104, 393–404.
  36. Clemens J.C., Worby C.A., Simonson-Leff N., Muda M., Maehama T., Hemmings B.A., Dixon J.E. (2000) Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 6499–6503.
  37. Baroni T.E., Chittur S.V., George A.D., Tenenbaum S.A. (2008) Advances in RIP-chip analysis: RNA-binding protein immunoprecipitation-microarray profiling. Methods Mol. Biol. 419, 93–108. doi: 10.1007/978-1-59745-033-1_6
  38. Kurshakova M., Maksimenko O., Golovnin A., Pulina M., Georgieva S., Georgiev P., Krasnov A. (2007) Evolutionarily conserved E(y)2/Sus1 protein is essential for the barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila. Mol. Cell. 27, 332–338.
  39. Kurshakova М.М., Yakusheva Y.A., Georgieva S.G. (2024) TREX-2-ORC complex of D. melanogaster participates in nuclear export of histone mRNA. Dokl. Biochem. Biophys. 514, 11‒15. https://doi.org/10.1134/S160767292370059X
  40. Huang Y., Steitz J.A. (2001) Splicing factors SRp20 and 9G8 promote the nucleocytoplasmic export of mRNA. Mol. Cell. 7, 899–905.
  41. Fan J., Wang K., Du X., Wang J., Chen S., Wang Y., Shi M., Zhang L., Wu X., Zheng D., Wang C., Wang L., Tian B., Li G., Zhou Y., Cheng H. (2019) ALYREF links 3′‐end processing to nuclear export of non‐polyadenylated mRNAs. EMBO J. 38, e99910.
  42. De Marco C., Zoppoli P., Rinaldo N., Morganella S., Morello M., Zuccalà V., Carriero M.V., Malanga D., Chirillo R., Bruni P., Malzoni C., Di Vizio D., Venturella R., Zullo F., Rizzuto A., Ceccarelli M., Ciliberto G., Viglietto G. (2021) Genome-wide analysis of copy number alterations led to the characterisation of PDCD10 as oncogene in ovarian cancer. Transl. Oncol. 14, 101013.
  43. Li J.-H., Tao Y.F., Shen C.H., Li R.D., Wang Z., Xing H., Ma E.S., Xue H.Y., Zhang Q.B., Ma Z.Y., Wang Z.X. (2022) Integrated multi-omics analysis identifies ENY2 as a predictor of recurrence and a regulator of telomere maintenance in hepatocellular carcinoma. Front. Oncol. 12, 939948.
  44. Xie G., Yang H., Ma D., Sun Y., Chen H., Hu X., Jiang Y., Shao Z. (2019) Integration of whole‐genome sequencing and functional screening identifies a prognostic signature for lung metastasis in triple‐negative breast cancer. Int. J. Cancer. 145, 2850–2860.
  45. Chen Q., Shi X., Bao Y., Sun G., Wu S., Chen Y. (2023) An integrative analysis of enhancer of yellow 2 homolog (ENY2) as a molecular biomarker in pan-cancer. Funct. Integr. Genomics. 23, 72.
  46. Wang C., Jiang X., Qi J., Xu J., Yang G., Mi C. (2022) PAIP2 is a potential diagnostic and prognostic biomarker of breast cancer and is associated with immune infiltration. Front. Genet. 13, 1009056.
  47. Fritz A.J., Ghule P.N., Boyd J.R., Tye C.E., Page N.A., Hong D., Shirley D.J., Weinheimer A.S., Barutcu A.R., Gerrard D.L., Frietze S., van Wijnen A.J., Zaidi S.K., Imbalzano A.N., Lian J.B., Stein J.L., Stein G.S. (2018) Intranuclear and higher-order chromatin organization of the major histone gene cluster in breast cancer. J. Cell. Physiol. 233, 1278–1290. HLB, nuclear body, histone genes, histone mRNA

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Белки Paip2 и ENY2 взаимодействуют друг с другом. а – Активация репортерного гена LacZ при добавлении субстрата β-галактозидазы CPRG. Результаты представлены в виде относительных единиц активности (о. е.) β-галактозидазы [GLb] (рассчитаны как частное от деления полученных значений активности (е. а.) на общий множитель) для дрожжей, котрансформированных векторами, кодирующими ENY2-LexA и Paip2-GAL4, ENY2-LexA и control-GAL4, а также ENY2-GAL4 и Paip2-LexA, ENY2-GAL4 и control-LexA. б – Связывание аффинно очищенных рекомбинантных белков GST-Paip2 и ENY2-His6 на глутатион-сефарозе. В качестве отрицательного контроля использован белок GST. в – Анализ специфичности антител. Иммуноблотинг белков тотального лизата S2-клеток (S2 ТЛ) и ядерного экстракта (ЯЭ) из эмбрионов D. melanogaster с использованием антител кролика к Paip2. г – Анализ взаимодействия Paip2 с ENY2. Иммуноблотинг белков, осажденных из тотальных лизатов S2-клеток антителами к Paip2 и ENY2, с использованием одноименных антител. Полосы, соответствующие легким цепям антител к Paip2 и ENY2, отмечены звездочками (* и ** соответственно). д – Анализ взаимодействия Paip2-FLAG и ENY2. Иммуноблотинг белков, осажденных антителами к ENY2 из лизатов S2-клеток со сверхэкспрессией Paip2-FLAG с использованием антител к FLAG-эпитопу и ENY2. е – Анализ взаимодействия Paip2 и ENY2 на генетическом уровне. Представлены фотографии абдоминальных сегментов самцов D. melanogaster с генотипом e(y)2[u1];KG03704/+ (нарушенная морфология) и контрольных самцов с генотипом FM4;KG03704/+ (нормальная морфология).

Скачать (51KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Paip2 взаимодействует с белковым комплексом TREX-2. а – Иммуноблотинг белков, осажденных из лизатов S2-клеток антителами к Paip2 и к субъединицам ENY2, Xmas-2 и PCID2 комплекса TREX-2. Указаны детектируемые белки. Полосы, соответствующие сигналам от легких цепей антител, отмечены по краям блота звездочками: *слева и **справа. б – Иммуноблотинг лизатов S2-клеток с нокдауном Paip2, Xmas-2, ENY2 в результате РНК-интерференции (Paip2-i, Xmas-2-i, ENY2-i соответственно) и контрольной РНК-интерференции c дцРНК к мРНК GFP (K) с использованием антител к одноименным белкам. В качестве выравнивающего контроля использовали окрашивание антителами к ламину Dm0. в – Распределение мРНК в S2-клетках при нокдауне Paip2, ENY2, Xmas-2 в результате РНК-интерференции (Paip2-i, ENY2-i, Xmas2-i соответственно) и контрольных клетках с РНК-интерференцией с дцРНК к мРНК GFP (контроль). FISH-гибридизацию РНК S2-клеток проводили с Cy3-меченым oligo-dT-зондом. Ядра клеток окрашены DAPI.

Скачать (42KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Paip2 и ENY2 локализуются в локусе кластера репликативнозависимых генов гистонов. a – Иммуноокрашивание политенных хромосом из ядер слюнных желез личинок D. melanogaster с использованием антител к Paip2. Для окрашивания ДНК использовали DAPI. Локус кластера репликативнозависимых генов гистонов указан стрелкой. Приведено увеличенное изображение окрашенного локуса. б – Иммуноокрашивание S2-клеток с использованием в качестве первичных мышиных антител к Paip2 и кроличьих антител к ENY2. Ядра клеток окрашены DAPI. в – FISH-гибридизация S2-клеток с His3-зондом, совмещенная с иммуноокрашиванием антителами к Paip2. Ядра клеток окрашены DAPI.

Скачать (59KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Белок Paip2 ассоциирован с мРНП-частицами гистонов. а – Результаты иммунопреципитации мРНК His2A из ядерной фракции S2-клеток антителами к Paip2 и субъединицам Xmas-2, PCID2, ENY2 комплекса TREX-2. В качестве отрицательного контроля использованы IgG кролика. Результаты иммунопреципитации РНК (RIP) представлены в процентах от исходного количества. б – Иммуноблотинг лизатов S2-клеток с нокдауном Paip2 (Paip2-i), а также GFP в качестве отрицательного контроля (K). Использованы антитела к Paip2, Xmas-2, PCID2 и ENY2. В качестве внутреннего контроля использовано окрашивание антителами к ламину Dm0. в – Результаты иммунопреципитации мРНК His2A антителами к Paip2, Xmas-2, PCID2, ENY2 при нокдауне Paip2. Представлены уровни мРНК His2A, осажденной антителами из экстрактов с нокдауном Paip2 (Paip2-i), нормализованные относительно уровня мРНК His2A, осажденной из экстрактов с нокдауном GFP, принятого за единицу (K). г – Иммуноблотинг лизатов S2-клеток с нокдауном Xmas-2 (Xmas-2-i) и нокдауном GFP в качестве отрицательного контроля (К) с использованием антител к Xmas-2 и Paip2. В качестве внутреннего контроля использовано окрашивание антителами к ламину Dm0. д – Результаты иммунопреципитации мРНП-частиц гена His2A антителами к Paip2 при нокдауне Xmas-2. Представлены уровни мРНК His2A, осажденной антителами из экстрактов с нокдауном Xmas-2 (Xmas-2-i), нормализованные относительно уровня мРНК His2A, осажденной из экстрактов с нокдауном GFP, принятого за единицу (K). Все данные на графиках представлены как среднее значение ± SD; для сравнения данных контроля и эксперимента использован t-критерий Стьюдента; *p-value < 0.05, **p-value < 0.01.

Скачать (33KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024