Адаптация метода получения трансгенных мышей на основе in utero электропорации

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Для получения трансгенных лабораторных мышей требуется дорогостоящее оборудование и высококвалифицированный персонал, имеющий навыки проведения манипуляций с зиготами. Ранее в литературе был описан ряд высокоэффективных методов электропорации зигот для доставки систем геномного редактирования. Один из них ‒ метод, названный i-GONAD (improved Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery), который заключается в редактировании генома посредством доставки нуклеиновых кислот в зиготы за счет электропорации в яйцеводе in utero. В данной работе эта технология применена для разработки простого в использовании и экономически выгодного способа, позволяющего редактировать геном мышей с нуля с минимальными требованиями к навыкам оператора и наименьшим количеством используемых животных. Мы выбрали систему CRISPR/Cas9 в качестве инструмента редактирования генома и i-GONAD в качестве метода доставки генов для получения мутаций в гене Il10 у мышей линии C57BL/6. Три животных (23%) из 13 родившихся детенышей имели генетические нарушения в локусе Il10, что указывает на применимость предложенного подхода. Данный протокол содержит подробное описание используемых методов в сочетании с рекомендациями по устранению ошибок и может представлять интерес для тех, кто стремится самостоятельно адаптировать технологию получения трансгенных мышей с нуля с минимальными затратами.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Ю. В. Попова

Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский государственный аграрный университет

Email: kozhevnikova@mcb.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090; Новосибирск, 630039

В. Д. Бец

Новосибирский государственный технический университет

Email: kozhevnikova@mcb.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630073

Е. С. Омелина

Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук

Email: kozhevnikova@mcb.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090

Л. В. Болдырева

Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук; Научно-исследовательский институт нейронаук и медицины

Email: kozhevnikova@mcb.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090; Новосибирск, 630117

Е. Н. Кожевникова

Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский государственный аграрный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: kozhevnikova@mcb.nsc.ru
Россия, Новосибирск, 630090; Новосибирск, 630039

Список литературы

  1. Takahashi G., Gurumurthy C.B., Wada K., Miura H., Sato M., Ohtsuka M. (2015) GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: a novel microinjection independent genome engineering method in mice. Sci. Rep. 5, 11406. https://doi.org/10.1038/srep11406
  2. Ohtsuka M., Sato M., Miura H., Takabayashi S., Matsuyama M., Koyano T., Arifin N., Nakamura S., Wada K., Gurumurthy C.B. (2018) I-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol. 19, 25. https://doi.org/10.1186/s13059-018-1400-x
  3. Sato M., Nakamura S., Inada E., Takabayashi S. (2022) Recent advances in the production of genome-edited rats. Int. J. Mol. Sci. 23(5), 2548. https://doi.org/10.3390/ijms23052548
  4. Hirose M., Tomishima T., Ogura A. (2023) Editing the genome of the golden hamster (Mesocricetus auratus). Meth. Mol. Biol. 2637, 247–254. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3016-7_19
  5. Namba M., Kobayashi T., Koyano T., Kohno M., Ohtsuka M., Matsuyama M. (2021) GONAD: A new method for germline genome editing in mice and rats. Dev. Growth. Differ. 63(8), 439–447. https://doi.org/10.1111/dgd.12746
  6. Kobayashi Y., Aoshima T., Ito R., Shinmura R., Ohtsuka M., Akasaka E., Sato M., Takabayashi S. (2020) Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain. Cells. 9(4), 957. https://doi.org/10.3390/cells9040957
  7. Shang R., Zhang H., Bi P. (2021) Generation of mouse conditional knockout alleles in one step using the i-GONAD method. Gen. Res. 31(1), 121–130. https://doi.org/10.1101/gr.265439.120
  8. Sato M., Nakamura A., Sekiguchi M., Matsuwaki T., Miura H., Gurumurthy C.B., Kakuta S., Ohtsuka M. (2023) Improved genome editing via oviductal nucleic acids delivery (i-GONAD): Protocol steps and additional notes. Meth. Mol. Biol. 2631, 325–340. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2990-1_14
  9. Melo-Silva C.R., Knudson C.J., Tang L., Kafle S., Springer L.E., Choi J., Snyder C.M., Wang Y., Kim S.V., Sigal L.J. (2023) Multiple and consecutive genome editing using i-GONAD and breeding enrichment facilitates the production of genetically modified mice. Cells. 12(9), 1343. https://doi.org/10.3390/cells12091343
  10. Gurumurthy C.B., Sato M., Nakamura A., Inui M., Kawano N., Islam M.A., Ogiwara S., Takabayashi S., Matsuyama M., Nakagawa S., Miura H., Ohtsuka M. (2019) Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nat. Protoc. 14(8), 2452–2482. https://doi.org/10.1038/s41596-019-0187-x
  11. Garcia-Frigola C., Carreres M.I., Vegar C., Herrera E. (2007) Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev. Biol. 7, 103. https://doi.org/10.1186/1471-213X-7-103
  12. Shinmyo Y., Tanaka S., Tsunoda S., Hosomichi K., Tajima A., Kawasaki H. (2016) CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Sci. Rep. 6, 20611. https://doi.org/10.1038/srep20611
  13. Book Reviews. (2002) J. Vet. Med. Educ. 29, 245–246. https://doi.org/10.3138/jvme.29.4.245
  14. Cagle L.A., Franzi L.M., Epstein S.E., Kass P.H., Last J.A., Kenyon N.J. (2017) Injectable anesthesia for mice: combined effects of dexmedetomidine, tiletamine-zolazepam, and butorphanol. Anesthesiol. Res. Pract. 2017, 9161040. https://doi.org/10.1155/2017/9161040
  15. Limprasutr V., Sharp P., Jampachaisri K., Pacharinsak C., Durongphongtorn S. (2021) Tiletamine/zolazepam and dexmedetomidine with tramadol provide effective general anesthesia in rats. Animal Model Exp. Med. 4(1), 40–46. https://doi.org/10.1002/ame2.12143
  16. Cohen J. (2016) “Any idiot can do it.” Genome editor CRISPR could put mutant mice in everyone’s reach. Science. https://doi.org/10.1126/science.aal0334
  17. Modzelewski A.J., Chen S., Willis B.J., Lloyd K.C.K., Wood J.A., He L. (2018) Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nat. Protoc. 13(6), 1253–1274. https://doi.org/10.1038/nprot.2018.012
  18. Imai Y., Tanave A., Matsuyama M., Koide T. (2022) Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method. Sci. Rep. 12(1), 13821. https://doi.org/10.1038/s41598-022-17776-x
  19. Weber E.M., Algers B., Würbel H., Hultgren J., Olsson I.A.S. (2013) Influence of strain and parity on the risk of litter loss in laboratory mice. Reprod. Domest Anim. 48(2), 292–296. https://doi.org/10.1111/j.1439-0531.2012.02147.x
  20. Carter D.B., Kennett M.J., Franklin C.L. (2002) Use of perphenazine to control cannibalism in DBA/1 mice. Comp. Med. 52(5), 452–455.
  21. Du Sert N.P., Hurst V., Ahluwalia A., Alam S., Avey M.T., Baker M., Browne W.J., Clark A., Cuthill I.C., Dirnagl U., Emerson M., Garner P., Holgate S.T., Howells D.W., Karp N.A., Lazic S.E., Lidster K., MacCallum C.J., Macleod M., Pearl E.J., Petersen O.H., Rawle F., Reynolds P., Rooney K., Sena E.S., Silberberg S.D., Steckler T., Würbel H. (2020) The arrive guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 18(7), e3000410. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000410

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Приложение
Скачать (1MB)
Метаданные
3. Рис. 1. Схема CRISPR/Cas9 редактирования генома в сочетании с методом i-GONAD. а – Синтез sgRNA (single guide RNA). б – Метод i-GONAD (improved Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery). в – Наложение швов и послеоперационные процедуры. Рисунок создан на сайте biorender.com.

Скачать (713KB)
Метаданные
4. Рис. 2. Адаптация и тестирование метода i-GONAD. а – Тестирование sgРНК in vitro. Электрофорез в агарозном геле ScaI-линеаризованного вектора pBlueScript SK (+), несущего фрагмент геномной области экзона 1 или экзона 2 гена Il10. RNP – рибонуклеарные комплексы sgРНК и белка Cas9. б – Выживаемость зигот in vitro после электропорации in utero. ЭП – электропорация. в – Тест на эффективность электропорации in utero с использованием 4кДa FITC-декстран (FD4).

Скачать (571KB)
Метаданные
5. Рис. 3. Генотипирование потомства. а – Схематическая иллюстрация локуса Il10 дикого типа. Экзоны (от ex1 до ex5) и интроны обозначены черными прямоугольниками и серой линией соответственно. Две целевые последовательности (ex1 и ex2) подчеркнуты и показаны синим цветом. Последовательности мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM), показаны красным. б – Прямое секвенирование по Сэнгеру геномных регионов гена Il10 в потомстве F1. Трансген #58 имеет нарушения в экзоне 1, два других (#27 и #32) – в экзоне 2 гена Il10. в – Сравнение аминокислотных последовательностей гена Il10 дикого типа и потомства после i-GONAD. Контрольная аминокислотная последовательность белка Il10 дикого типа показана сверху. Аминокислотные последовательности мутированных белков Il10 (полученных из трансгенов #58, #27 и #32) показаны ниже. Прогнозируемые последствия мутации аминокислотных последовательностей выделены красным. Стоп-кодоны обозначены *.

Скачать (1MB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024