Количественный анализ биомолекулярных конденсатов на модифицированной подложке

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Биомолекулярные конденсаты представляют собой скопления биополимеров, образующиеся в водных растворах по механизму разделения фаз “жидкость–жидкость”. Нарушения фазовых переходов белков и нуклеиновых кислот в клетке лежат в основе ряда патологий, и необходимость их моделирования in vitro стимулирует развитие методов исследования конденсатов. В данной работе рассмотрена ключевая проблема визуализации конденсатов меченых белков и РНК методом флуоресцентной микроскопии в бесклеточных моделях. Она сводится к тому, что подвижность конденсатов в слое образца на стекле осложняет обработку и интерпретацию данных. Для ее решения ранее предлагалось иммобилизовать конденсаты на модифицированной подложке – стекле, обработанном 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС). Такая подложка предполагает нековалентное связывание РНК/ДНК и неоптимальна для белковых конденсатов. С помощью обработки АПТЭС N,N′-дисукцинимидилкарбонатом нами была получена альтернативная подложка ДСК-АПТЭС для ковалентного связывания конденсатов по лизиновым остаткам экспонированных на поверхности конденсата белковых фрагментов. Сравнительный анализ образцов известных конденсатов на всех трех типах подложки выявил значимое снижение их подвижности на модифицированной (АПТЭС или ДСК-АПТЭС) подложке, причем оптимальный тип модификации зависел от состава конденсатов. Эффективная иммобилизация улучшила качество фокусировки, что проявилось в повышении показателя солокализации олигонуклеотидного и белкового компонентов, а также упростила количественный анализ разделения фаз на основе объемной доли конденсатов в образце. Для идентификации конденсатов и автоматизации расчета их доли была разработана программа Droplet_Calc. Полученные с ее помощью данные подтверждают преимущества АПТЭС и ДСК-АПТЭС в сравнении с немодифицированным стеклом при анализе концентрационной зависимости доли конденсатов для построения фазовых диаграмм. Оптимизация подложки и автоматизация обработки изображений открывают возможность быстрого и надежного количественного анализа фазовых переходов биополимеров методами микроскопии, что может быть востребовано в скрининге терапевтических агентов для разрушения патогенных конденсатов.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. С. Шторк

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. акад. Ю.М. Лопухина ФМБА России

Автор, ответственный за переписку.
Email: vedekhina.ts@rcpcm.ru
Россия, Москва

Ю. И. Павлова

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. акад. Ю.М. Лопухина ФМБА России

Email: vedekhina.ts@rcpcm.ru
Россия, Москва

Ю. И. Светлова

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. акад. Ю.М. Лопухина ФМБА России

Email: vedekhina.ts@rcpcm.ru
Россия, Москва

М. С. Юдин

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. акад. Ю.М. Лопухина ФМБА России

Email: vedekhina.ts@rcpcm.ru
Россия, Москва

Е. Н. Графская

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. акад. Ю.М. Лопухина ФМБА России

Email: vedekhina.ts@rcpcm.ru
Россия, Москва

В. А. Манувера

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. акад. Ю.М. Лопухина ФМБА России

Email: vedekhina.ts@rcpcm.ru
Россия, Москва

С. Э. Алиева

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. акад. Ю.М. Лопухина ФМБА России

Email: vedekhina.ts@rcpcm.ru
Россия, Москва

А. М. Варижук

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. акад. Ю.М. Лопухина ФМБА России

Email: vedekhina.ts@rcpcm.ru
Россия, Москва

В. Н. Лазарев В. Н. Лазарев В. Н. Лазарев

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. акад. Ю.М. Лопухина ФМБА России

Email: vedekhina.ts@rcpcm.ru
Россия, Москва

Т. С. Ведехина

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. акад. Ю.М. Лопухина ФМБА России; МИРЭА – Российский технологический университет

Email: vedekhina.ts@rcpcm.ru
Россия, Москва; Москва

Список литературы

  1. Flory P.J. // J. Chem. Phys. 1949. V. 17. P. 303–310. https://doi.org/10.1063/1.1747243
  2. Dignon G.L., Best R.B., Mittal J. // Annu. Rev. Phys. Chem. 2020. V. 71. P. 53–75. https://doi.org/10.1146/annurev-physchem-071819-113553
  3. Bergeron-Sandoval L.-P., Safaee N., Michnick S.W. // Cell. 2016. V. 165. P. 1067–1079. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.05.026
  4. Mehta S., Zhang J. // Nat. Rev. Cancer. 2022. V. 22. P. 239–252. https://doi.org/10.1038/s41568-022-00444-7
  5. Erdel F., Rippe K. // Biophys. J. 2018. V. 114. P. 2262–2270. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2018.03.011
  6. Ilık İ.A., Aktaş T. // FEBS J. 2022. V. 289. P. 7234–7245. https://doi.org/10.1111/febs.16117
  7. Svetlova J.I., Pavlova Iu.I., Aralov A.V., Varizhuk A.M. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2023. V. 49. P. 917–929. https://doi.org/10.1134/S1068162023050229
  8. Rekulapally P., Suresh S.N. // Trends Biochem. Sci. 2019. V. 44. P. 993–995. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2019.10.001
  9. Protter D.S.W., Parker R. // Trends Cell Biol. 2016. V. 26. P. 668–679. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2016.05.004
  10. Wang B., Zhang L., Dai T., Qin Z., Lu H., Zhang L., Zhou F. // Sig. Transduct. Target Ther. 2021. V. 6. P. 290. https://doi.org/10.1038/s41392-021-00678-1
  11. Ganser L.R., Myong S. // Trends Biochem. Sci. 2020. V. 45. P. 1004–1005. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2020.05.011
  12. Alberti S., Gladfelter A., Mittag T. // Cell. 2019. V. 176. P. 419–434. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.12.035
  13. Erkamp N.A., Qi R., Welsh T.J., Knowles T.P.J. // Lab Chip. 2023. V. 23. P. 9–24. https://doi.org/10.1039/D2LC00622G
  14. Chen C., Li P., Luo W., Nakamura Y., Dimo V.S., Kanekura K., Hayamizu Y. // Langmuir. 2021. V. 37. P. 5635–5641. https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.1c00493
  15. Chen C., Jia H., Nakamura Y., Kanekura K., Hayamizu Y. // ACS Omega. 2022. V. 7. P. 19280–19287. https://doi.org/10.1021/acsomega.2c00811
  16. Saar K.L., Morgunov A.S., Qi R., Arter W.E., Krainer G., Lee A.A., Knowles T.P.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2021. V. 118. P. e2019053118. https://doi.org/10.1073/pnas.2019053118
  17. Cascarina S.M., Ross E.D. // J. Biol. Chem. 2022. V. 298. P. 101677. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.101677.
  18. Perdikari T.M., Murthy A.C., Ryan V.H., Watters S., Naik M.T., Fawzi N.L. // EMBO J. 2020. V. 39. P. e106478. https://doi.org/10.15252/embj.2020106478
  19. Iserman C., Roden C.A., Boerneke M.A., Sealfon R.S.G., McLaughlin G.A., Jungreis I., Fritch E.J., Hou Y.J., Ekena J., Weidmann C.A., Theesfeld C.L., Kellis M., Troyanskaya O.G., Baric R.S., Sheahan T.P., Weeks K.M., Gladfelter A.S. // Mol Cell. 2020. V. 80. P. 1078–1091. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.11.041
  20. Zheng X., Peng Q., Wang L., Zhang X., Huang L., Wang J., Qin Z. // Int. J. Biol. Sci. 2020. V. 16. P. 2442– 2453. https://doi.org/10.7150/ijbs.46751
  21. Fargason T., De Silva N.I.U., King E., Zhang Z., Paul T., Shariq J., Zaharias S., Zhang J. // Elife. 2023. V. 12. P. e84412. https://doi.org/10.7554/eLife.84412
  22. Hermanson G.T. // Bioconjugate Techniques, 3rd ed. Amsterdam: Elsevier BV, 2013. https://www.sciencedirect.com/book/9780123822390/bioconjugate-techniques
  23. Koniev O., Wagner A. // Chem. Soc. Rev. 2015. V. 44. P. 5495–5551. https://doi.org/10.1039/c5cs00048c
  24. Svetlova J., Gustin D., Manuvera V., Shirokov D., Shokina V., Prusakov K., Aldarov K., Kharlampieva D., Matyushkina D., Bespyatykh J., Varizhuk A., Lazarev V., Vedekhina T. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. P. 13220. https://doi.org/10.3390/ijms232113220
  25. Matyushkina D., Shokina V., Tikhonova P., Manuvera V., Shirokov D., Kharlampieva D., Lazarev V., Varizhuk A., Vedekhina T., Pavlenko A., Penkin L., Arapidi G., Pavlov K., Pushkar D., Kolontarev K., Rumyantsev A., Rumyantsev S., Rychkova L., Govorun V. // Viruses. 2022. V. 14. P. 1141. https://doi.org/10.3390/v14061141
  26. Hong Y., Najafi S., Casey T., Shea J.E., Han S.I., Hwang D.S. // Nat. Commun. 2022. V. 13. P. 7326. https://doi.org/10.1038/s41467-022-35001-1
  27. Roden C.A, Dai Y., Giannetti C.A., Seim I., Lee M., Rachel Sealfon, McLaughlin G.A., Boerneke M.A., Iserman C., Wey S.A., Ekena J.L., Troyanskaya O.G., Weeks K.M., You L., Chilkoti A., Gladfelter A.S. // Nucleic Acids Res. 2022. V. 50. P. 8168–8192. https://doi.org/10.1093/nar/gkac596
  28. Kurreck J. // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 1911– 1918. https://doi.org/10.1093/nar/30.9.1911
  29. Svetlova J., Knizhnik E., Manuvera V., Severov V., Shirokov D., Grafskaia E., Bobrovsky P., Matyugina E., Khandazhinskaya A., Kozlovskaya L., Miropolskaya N., Aralov A., Khodarovich Y., Tsvetkov V., Kochetkov S., Lazarev V., Varizhuk A. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. P. 15281. https://doi.org/10.3390/ijms232315281
  30. Пелевин Е.Е., Балясный С.В. // Juvenis Scientia. 2017. № 1. P. 4–7. https://doi.org/10.15643/JSCIENTIA.2017.1.001
  31. Gallois B., Candelier R. // PLoS Comput. Biol. 2021. V. 17. P. e1008697. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008697

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис 1. Формирование биоконденсатов и их взаимодействия с подложками. На верхней панели схематично показано формирование конденсатов на основе пептидов или белков с неструктированными доменами. На нижней панели изображены вероятные контакты экспонированных на поверхности конденсата фрагментов биополимеров с поверхностью стеклянной подложки или подложки, обработанной 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС), а также подложки, полученной путем функционализации АПТЭС N,N′-дисукцинимидилкарбонатом (ДСК) в присутствии диизопропилэтиламина (ДИЭА). При контакте с немодифицированной стеклянной подложкой ключевую роль, предположительно, играют водородные связи и ван-дер-ваальсовые взаимодействия. АПТЭС-подложка способна к кулоновским взаимодействиям с фосфатами РНК-остова. ДСК-АПТЭС-подложка несет на поверхности активированную карбоксильную группу для ковалентного присоединения белков по остатками лизина с образованием соответствующего амида. Побочный продукт функционализации (результат взаимодействия ДСК с двумя соседними остатками АПТЭС), а также накапливающийся при инкубации в водных растворах продукт гидролиза ДСК-АПТЭС способны дополнительно фиксировать конденсаты за счет слабых нековалентных взаимодействий.

Скачать (350KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Анализ влияния модификации подложки на подвижность конденсатов. (а) – Визуализация конденсатов на различных подложках методом флуоресцентной микроскопии непосредственно после нанесения (верхний ряд) и после 5 мин инкубации (нижний ряд). Левая панель: конденсаты SR-пептида (10 мг/мл, 1% FITC-меченого) с РНК (10 мг/мл) в 10 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7.4). Правая панель: конденсаты N-белка (50 мкМ, 15% RED-меченого) с РНК (0.5 мг/мл) в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7) с добавлением 50 мМ NaCl; (б) – примеры изображений, полученных с интервалом в 30 с для анализа подвижности конденсатов; (в) – результаты полуавтоматического анализа подвижности конденсатов. Анализ включал расчет среднеквадратичного смещения конденсата за 10 с на основании траектории из 3–5 кадров, сделанных с 10-секундным интервалом, с визуальным контролем построения траектории. Представлено обобщение данных по 10 траекториям на каждом типе подложки. * p < 0.05; ** p < 0.01 (тест Стьюдента, тест Манна–Уитни); (г) – результаты автоматического анализа подвижности конденсатов. Гистограммы распределения среднеквадратичного отклонения построены по 100 траекториям для каждого типа подложки без визуального контроля построения траекторий.

Скачать (289KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Анализ влияния подложки на соотношение компонентов конденсатов и фазовое состояние системы. (а) – Примеры визуализации конденсатов N-белка (50 мкМ, 15% RED-меченого) с РНК (0.5 мг/мл, 15% FAM-меченного LNA-олигонуклеотида) в натрий-фосфатном буферном растворе (pH 7) по флуоресценции белка (в красном канале) и LNA (в зеленом канале); (б) – оценка солокализации белка и LNA в конденсатах по данным флуоресцентной микроскопии (три повтора на каждый тип подложки). Количественный анализ включал расчет процента капель, визуализированных в обоих каналах (метод 1) и определение коэффициента корреляции Пирсона, отражающего корреляцию интенсивностей флуоресценции в красном и зеленом каналах (метод 2). * p < 0.05 (тест Стьюдента); (в) – примеры визуализации растворения конденсатов и их перехода в гель, индуцированные добавлением 10% 1,6-гександиола (HD) и лиганда на основе перилена (Peryl-3b) до финальной концентрации 20 мкМ, на различных подложках.

Скачать (238KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Анализ влияния подложки на наблюдаемую площадь конденсатов и получаемые фазовые диаграммы. (а) – Сравнение нормированной общей площади конденсатов на единицу площади покровного стекла при различных концентрациях белка и РНК, рассчитанной в программе Droplet_Calc для трех серий изображений: на стекле (серый), на АПТЭС-подложке (оранжевый) или на ДСК-АПТЭС (зеленый). Значения нормированы на максимальные для каждой серии, результаты (фрагменты фазовых диаграмм) представлены в формате тепловых карт; (б) – примеры изображений, соответствующие диагональным элементам тепловых карт; (в) – ненормированные значения общей площади конденсатов, соответствующие диагональным элементами тепловых карт в панели (а) и изображениям в панели (б).

Скачать (239KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025