TOLERANCE OF ADVENTIVE MACROPHYTE LEMNA GIBBA L. TO COPPER IONS: RANGE EVALUATION

Full Text

Введение В настоящее время на общемировом уровне наблюдается активизация процессов адвентизации флоры, что является прямым следствием возрастающей антропогенной нагрузки на природные экосистемы. Адвентивные виды растений вытесняют виды местной флоры, становясь эдификаторами и доминантами растительных сообществ, чем представляют собой серьезную угрозу региональному биологическому разнообразию [1]. Во всех странах мира уделяется большое внимание изучению адвентивных видов, механизмов их внедрения и характера миграций. На сегодняшний день выполнен большой объем исследований процессов адвентизации флоры: проведена инвентаризация, дана подробная биоэкологическая характеристика, изучена динамика биологического разнообразия, выявлены закономерности распределения [6; 30]. Однако недостаточно изученными остаются эколого-физиологические механизмы адаптации, позволяющие чужеродным растениям внедряться в природные сообщества и успешно конкурировать с аборигенными видами. Lemna gibba L. (ряска горбатая) - плавающий водный макрофит из семейства Lemnacea, относится к числу активно расселяющихся представителей адвентивной фракции флоры и встречается почти на всех обитаемых континентах [20]. L. gibba характеризуется как агрессивный инвазивный вид, предпочитающий произрастать в эвтрофных водных экосистемах. До недавнего времени этот вид не имел широкого распространения в умеренных областях Северного полушария из-за климатических особенностей, в том числе и на территории России. Однако в зарубежной и отечественной литературе все чаще стали появляться сообщения о быстром распространении этого вида по территории Евразии. В России распространение вида с запада на восток пока ограничено Западной Сибирью (Курганская и Тюменская области, ХМАО-Югра) [2]. К настоящему времени опубликовано значительное число работ, посвященных изучению вариантов использования L. gibba для очистки сточных и рудничных вод от тяжелых металлов (ТМ) и других поллютантов [14; 23; 24; 28; 29; 31]. Большой интерес у исследователей вызывают аспекты, связанные с изучением механизмов устойчивости этого макрофита к действию меди [8; 10; 18; 25]. Медь характеризуется не только высоким уровнем токсичности среди других ТМ в ряду Ирвинга-Вильямса [16; 17; 19], но и тем, что является важным эссенциальным элементом, который необходим для роста и развития растений [12; 15; 22]. Однако, будучи редокс-активным металлом, медь может напрямую участвовать в генерации высокотоксичных активных форм кислорода (АФК) и вызывать окислительный стресс в клетках растений [18; 22; 23]. В большинстве случаев исследования направлены на оценку аккумулятивной способности L. gibba в отношении меди и возможностей использования этого вида для биоиндикационных и фиторемедиационных целей [11; 13; 24; 27]. Однако ответные физиолого-биохимические реакции этого адвентивного макрофита изучены недостаточно. Кроме того, в связи с ростом антропогенной нагрузки на водные экосистемы, все большую актуальность приобретает поиск доступных и эффективных биомаркеров токсичности, что позволит оперативно оценить степень воздействия и спрогнозировать состояние гидроценозов. Таким образом, данное исследование было направлено на оценку пределов толерантности L. gibba к действию меди и выявление репрезентативных физиолого-биохимических параметров, перспективных для использования в качестве биомаркеров токсичности. Материалы и методы исследования Объектом исследования были растения L. gibba, отобранные в середине июля 2019 г. из естественной популяции, обитающей в пруду-отстойнике сточных вод Северского трубного завода (г. Полевской, Свердловская область). Данный водоем характеризуется высоким уровнем техногенного загрязнения, в том числе и повышенным содержанием меди, которое в среднем в 8 раз превышало предельно допустимую концентрацию для водных объектов рыбохозяйственного назначения [7]. Растения промывали проточной, а затем дистиллированной водой и инкубировали в цилиндрических сосудах объемом 3 л в течение 6 суток на 5%-ной питательной среде Хогланда-Арнона I (без микроэлементов). В опытные варианты добавляли сульфат меди в концентрации 0,1; 0,25; 0,5; 1; 5 и 10 мг/л (в расчете на ион). Контролем служили сосуды со средой без добавления меди. Растения инкубировали при естественном освещении (фотопериод 16:8) и температуре 24°С ± 2°С. Визуальную оценку депигментации фрондов ряски и степени некротических изменений проводили по окончании срока инкубирования. Содержание меди в фрондах L. gibba определяли с помощью атомно-абсорбционного спектрометра AA240FS (Varian, США) после мокрого озоления 70% HNO3 осч. Определение содержания пероксида водорода, продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и фотосинтетических пигментов проводили спектрофотометрически на PD-303UV (APEL, Япония) в четырех биологических повторностях. Содержание пероксида водорода определяли с использованием ксиленолового реактива при 560 нм; продуктов ПОЛ (в расчете на малоновый диальдегид, МДА) - с использованием тиобарбитуровой кислоты при 532 и 600 нм [3]. Фотосинтетические пигменты экстрагировали в 80%-м растворе ацетона; содержание хлорофилла а (Хл а), хлорофилла b (Хл b) и каротиноидов измеряли при 665, 649 и 440 нм и рассчитывали согласно Lichtenthaler [21]. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Excel 2010 и Statistica 10. Достоверность различий между вариантами оценивали согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни при уровне значимости р < 0,05. Коэффициенты ранговой корреляции рассчитывали по Спирмену. Результаты и их обсуждение Анализ полученных результатов по содержанию меди в фрондах L. gibba через 6 суток инкубации на возрастающих концентрациях иона от 0 до 10 мг/л позволил охарактеризовать рост накопления металла как экспоненциальный (рис. 1). Выявлена высокая положительная корреляция между содержанием меди в растворе и в растениях (r = 0,99; р < 0,05). За 6 суток инкубации на максимальной концентрации металла фронды ряски накапливали до 630 мг Cu2+/кг сухого веса. Были выявлены достоверные различия концентраций металла в растениях, инкубированных в растворах с концентрацией меди от 0,25 до 10 мг/л. При этом до концентрации меди в питательной среде 1 мг/л прирост аккумуляции металла в тканях макрофита составлял в среднем 60%. Концентрации, превышающие 1 мг/л меди в среде, вызывали резкое увеличение накопления металла (в среднем в 40 раз по сравнению с контролем). Отсутствие линейной зависимости между концентрацией металла в среде и его содержанием в растениях L. gibba отмечалось и ранее [4]. Возможно, это связано с нарушением функционирования барьерных механизмов вследствие окисления липидов мембранных комплексов [9; 15; 18]. Примечание: линией показан экспоненциальный рост содержания Cu2+ в тканях макрофита; * - достоверные различия от контроля при p < 0,05 Рис. 1. Накопление меди в фрондах L. gibba за 6 суток инкубации на разных концентрациях металла Повышенные концентрации меди в среде вызывали развитие окислительного стресса у L. gibba. Достоверно значимые различия от контроля по содержанию пероксида водорода были зафиксированы, начиная с концентрации Cu2+ в среде, равной 0,1 мг/л, а по уровню продуктов ПОЛ - с 5 мг/л (рис. 2). При максимальной концентрации металла в среде (10 мг/л) содержание пероксида водорода в фрондах ряски было в 3,0, а содержание МДА - в 1,4 раза выше, чем в контроле. Расчет коэффициента ранговой корреляции Спирмена показал высокую положительную связь между содержанием меди в растворе и содержанием прооксидантов (как МДА, так и пероксида водорода, r = 0,99; р < 0,05). По-видимому, интенсивное образование пероксида водорода активировало процессы ПОЛ, что, как следствие, привело к нарушению структуры клеточных мембран и изменению их проницаемости для ионов меди, способствуя их активному поступлению в клетки макрофита. Примечание: *- достоверные различия от контроля при p < 0,05 Рис. 2. Содержание пероксида водорода и малонового диальдегида в фрондах L. gibba через 6 суток инкубации на разных концентрациях меди Для оценки влияния меди на состояние пигментного комплекса L. gibba были изучены степень депигментации растений и содержание фотосинтетических пигментов. Исследование показало, что для фотосинтетического аппарата ряски характерна достаточно высокая устойчивость к действию этого металла. За 6 суток инкубации заметные изменения окраски фрондов ряски наблюдались лишь при концентрации ≥ 0,5 мг/л. С возрастанием концентрации меди в среде наблюдалось дальнейшее усиление депигментации, которая выражалась в изменении окраски фрондов L. gibba от темно-зеленой до желтовато-зеленой (рис. 3). Рис. 3. Состояние фрондов L. gibba через 6 суток инкубации в градиенте концентраций меди Примечание: * - достоверные различия от контроля при p < 0,05. Рис. 4. Содержание фотосинтетических пигментов (а) и их соотношение (б, в) в фрондах L. gibba через 6 суток инкубации на разных концентрациях меди Вероятно, это явление происходило вследствие деградации фотосинтетических пигментов. Кроме того, в градиенте концентраций ионов меди активизировались некротические процессы, сопровождающиеся повреждением и отмиранием фрондов: при максимальной концентрации меди в среде (10 мг/л) доля поврежденных фрондов L. gibba составляла около 70% от их общего количества. При возрастании концентраций ионов меди в среде до 0,5 мг/л содержание хлорофиллов у L. gibba достоверно не изменялось (рис. 4а). Концентрация меди 0,25 мг/л в некоторой степени вызывала стимуляцию синтеза фотосинтетических пигментов (в среднем на 10% от контроля). Подобный положительный эффект низких концентраций токсиканта (наподобие эффекта «гормезиса») был отмечен у другого вида ряски [26]: у Lemna trisulсa при действии низких концентраций ионов меди - от 1 до 10 мкМ. Более высокие концентрации меди вызывали деградацию как хлорофиллов, так и каротиноидов. При максимальной концентрации меди (10 мг/л) содержание хлорофиллов было ниже в среднем в 2,5 раза, а каротиноидов - в 11,5 раз по сравнению с контрольными значениями. Степень активности фотосинтетического аппарата часто оценивают по соотношению хлорофиллов (Хл a/b) и отношению хлорофиллов к каротиноидам. При возрастании концентрации меди от 0,5 до 10,0 мг/л отношение хлорофилла a к хлорофиллу b снижалось в 2 раза (рис. 4б). Это связано с более резким уменьшением количества Хл а в градиенте концентраций меди, в то время как Хл b оказался более устойчивым к действию этого металла. Пониженная величина соотношения Хл a/b у L. gibba свидетельствует о том, что значительная часть хлорофиллов находится в светособирающем комплексе фотосистем [5]. Анализ соотношения суммы вспомогательных пигментов (Хл b + Каротиноиды) к основному (Хл a), характеризующего долю антенных форм, показал его достоверное увеличение в фрондах ряски при инкубировании в среде с концентрациями меди 5 и 10 мг/л (рис. 4б). При этом отношение суммы хлорофиллов к каротиноидам, характеризующее в целом светособирающую функцию пигментного комплекса, также достоверно возрастало (рис. 4в). В целом обнаружена высокая отрицательная корреляция между концентрацией меди в среде и содержанием фотосинтетических пигментов (r = -0,87; р < 0,05). Выводы Результаты модельного эксперимента позволили установить достоверный фитотоксический эффект действия ионов меди на L. gibba в концентрации ≥ 0,5 мг/л, что выражалось в повышении содержания прооксидантов (пероксида водорода и малонового диальдегида), а также депигментации фрондов ряски из-за деградации фотосинтетических пигментов. Несмотря на это, исследуемый адвентивный вид продемонстрировал достаточно высокую устойчивость к меди, что, вероятно, позволяет ему быть более конкурентоспособным, чем аборигенные водные растения, и успешно внедряться на новые территории в условиях повышенного загрязнения природных водоемов тяжелыми металлами. Проведенное исследование позволило оценить пределы толерантности L. gibba к действию меди и выявить репрезентативные физиолого-биохимические параметры, которые можно рекомендовать в качестве биомаркеров токсичности.

About the authors

D. A Shchukina

Ural Federal University named after the first President of Russia B.N. Yeltsin

G. G Borisova

Ural Federal University named after the first President of Russia B.N. Yeltsin

Dr. habil.

M. G Maleva

Ural Federal University named after the first President of Russia B.N. Yeltsin

Ph.D.

References

Supplementary files