Изучение стохастической упаковки белков Cas в экзосомы

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Системы CRISPR/Cas являются перспективными молекулярными инструментами для направленных манипуляций с генетическим материалом, включая редактирование генома, регуляцию транскрипции генов, модификацию эпигенома. Несмотря на высокую эффективность и возможность использования систем CRISPR/Cas при различных наследственных, инфекционных и онкологических заболеваниях, отсутствие эффективных методов упаковки и доставки этих систем in vivo препятствует их внедрению в клиническую практику. Современные платформы для доставки генетических конструкций на основе синтетических наночастиц органической и неорганической природы имеют ряд ограничений, а именно низкую эффективность упаковки, иммуногенность, токсичность, отсутствие тропности, сложный и дорогой процесс производства. Экзосомы, секретируемые клетками эукариот, представляют собой биологические наночастицы, которые обладают высочайшей биосовместимостью, физико-химической стабильностью и способностью преодолевать биологические барьеры. Безопасность использования экзосом подтверждена в многочисленных клинических исследованиях. В последние годы экзосомы рассматриваются как перспективные носители для доставки систем CRISPR/Cas in vivo. В представленной работе на различных линиях клеток определена эффективность стохастической упаковки систем CRISPR/Cas в экзосомы. Показано, что белок Cas9 локализуется в компартменте биогенеза экзосом, однако стохастическая упаковка Cas9 в экзосомы обеспечивает попадание белка Cas9 всего в ~1% целевых клеток. Низкая эффективность стохастической упаковки белка Cas9 не позволяет использовать этот метод в генетическом редактировании. Следовательно, необходимы новые методы и технологии загрузки CRISPR/Cas-систем в экзосомы.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Н. И. Пономарева

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет); Научно-технологический университет “Сириус”

Автор, ответственный за переписку.
Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru

Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского, Кафедра фармацевтической и токсикологической химии

Россия, Москва, 119435; Сочи, 354340

С. А. Брезгин

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет); Научно-технологический университет “Сириус”

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru

Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского

Россия, Москва, 119435; Сочи, 354340

А. П. Костюшева

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет)

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru

Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского

Россия, Москва, 119435

О. В. Слатинская

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru

Биологический факультет

Россия, Москва, 119991

Е. О. Баюрова

Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова Российской академии наук

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru
Россия, Москва, 108819

И. В. Гордейчук

Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова Российской академии наук

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru
Россия, Москва, 108819

Г. В. Максимов

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru

Биологический факультет

Россия, Москва, 119991

Д. В. Соколова

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru
Россия, Москва, 115478

Г. Бабаева

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru
Россия, Москва, 115478

И. И. Хан

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru
Россия, Москва, 115478

В. С. Покровский

Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru
Россия, Москва, 115478

А. С. Лукашев

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет)

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru

Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского

Россия, Москва, 119435

В. П. Чуланов

Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний Минздрава России

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru
Россия, Москва, 127994

Д. С. Костюшев

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет); Научно-технологический университет “Сириус”

Email: ponomareva.n.i13@yandex.ru

Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского

Россия, Москва, 119435; Сочи, 354340

Список литературы

  1. Банников А.В., Лавров А.В. (2017) CRISPR/Cas9 – король геномного редактирования. Молекуляр. биология. 51, 582–594.
  2. Wiedenheft B., Sternberg S.H., Doudna J.A. (2012) RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482, 331–338.
  3. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J., Agarwala V., Scott D.A., Zhang F. (2013) Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8, 2281–2308.
  4. Kostyushev D., Brezgin S., Kostyusheva A., Zarifyan D., Goptar I., Chulanov V. (2019) Orthologous CRISPR/Cas9 systems for specific and efficient degradation of covalently closed circular DNA of hepatitis B virus. Cell. Mol. Life Sci. 76, 1779–1794.
  5. Brezgin S., Kostyusheva A., Kostyushev D., Chulanov V. (2019) Dead Cas systems: types, principles, and applications. Int. J. Mol. Sci. 20(23), 6041.
  6. Kostyusheva A., Brezgin S., Babin Y., Vasilyeva I., Glebe D., Kostyushev D., Chulanov V. (2022) CRISPR-Cas systems for diagnosing infectious diseases. Methods. 203, 431–446.
  7. Chen S., Lee B., Lee A.Y., Modzelewski A.J., He L. (2016) Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J. Biol. Chem. 291(28), 14457–14467.
  8. Bharathkumar N., Sunil A., Meera P., Aksah S., Kannan M., Saravanan K.M., Anand T. (2022) CRISPR/Cas-based modifications for therapeutic applications: a review. Mol. Biotechnol. 64, 355–372.
  9. Brezgin S., Kostyusheva A., Ponomareva N., Volia V., Goptar I., Nikiforova A., Shilovskiy I., Smirnov V., Kostyushev D., Chulanov V. (2020) Clearing of foreign episomal DNA from human cells by crispra-mediated activation of cytidine deaminases. Int. J. Mol. Sci. 21, 1–17.
  10. Kostyushev D., Brezgin S., Kostyusheva A., Ponomareva N., Bayurova E., Zakirova N., Kondrashova A., Goptar I., Nikiforova A., Sudina A., Babin Y., Gordeychuk I., Lukashev A., Zamyatnin A., Ivanov A., Chulanov V. (2023) Transient and tunable CRISPRa regulation of APOBEC/AID genes for targeting hepatitis B virus. Mol. Ther. Nucl. Acids. 32, 478–493.
  11. Kostyushev D., Kostyusheva A., Brezgin S., Ponomareva N., Zakirova N.F., Egorshina A., Yanvarev D.V., Bayurova E., Sudina A., Goptar I., Nikiforova A., Dunaeva E., Lisitsa T., Abramov I., Frolova A., Lukashev A., Gordeychuk I., Zamyatnin A.A., Ivanov A., Chulanov V. (2023) Depleting hepatitis B virus relaxed circular DNA is necessary for resolution of infection by CRISPR-Cas9. Mol. Ther. Nucl. Acids, 31, 482–493.
  12. Костюшева А.П., Костюшев Д.С., Брезгин С.А., Зарифьян Д.Н., Волчкова Е.В., Чуланов В.П. (2019) Низкомолекулярные ингибиторы путей репарации двухцепочечных разрывов ДНК усиливают противовирусное действие системы CRISPR/Cas9 на моделях вируса гепатита B. Молекуляр. биология. 53, 311–323.
  13. Костюшева А.П., Брезгин С.А., Пономарева Н.И., Гоптарь И.А., Никифорова А.В., Гегечкори В.И., Полуэктова В.Б., Туркадзе К.А., Судина А.Е., Чуланов В.П., Костюшев Д.С. (2022) Противовирусное действие рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas9 на модели вируса гепатита В in vivo. Молекуляр. биология. 56, 884–891.
  14. Sharma G., Sharma A.R., Bhattacharya M., Lee S., Chakraborty C. (2021) CRISPR-Cas9 : a preclinical and clinical perspective for the treatment of human diseases. Mol. Ther. 29(2), 571–586.
  15. Rafii S., Tashkandi E., Bukhari N., Al-shamsi H.O. (2022) Current status of CRISPR/Cas9 application in clinical cancer research: opportunities and challenges. Cancers (Basel). 14(4), 1–14.
  16. Kostyushev D., Kostyusheva A., Brezgin S., Smirnov V., Volchkova E., Lukashev A., Chulanov V. (2020) Gene editing by extracellular vesicles. Int. J. Mol. Sci. 21, 1–34.
  17. Li A., Lee C.M., Hurley A.E., Jarrett K.E., De Giorgi M., Lu W., Balderrama K.S., Doerfler A.M., Deshmukh H., Ray A., Bao G., Lagor W.R. (2019) A self-deleting AAV-CRISPR system for in vivo genome editing. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 12, 111–122.
  18. Scott T., Moyo B., Nicholson S., Maepa M.B., Watashi K., Ely A., Weinberg M.S., Arbuthnot P. (2017) SsAAVs containing cassettes encoding SaCas9 and guides targeting hepatitis B virus inactivate replication of the virus in cultured cells. Sci. Rep. 7 (1), 7401.
  19. Bulcha J.T., Wang Y., Ma H., Tai P.W.L., Gao G. (2021) Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct. Target. Ther. 6(1), 53.
  20. Jiang C., Mei M., Li B., Zhu X., Zu W., Tian Y., Wang Q., Guo Y., Dong Y., Tan X. (2017) A non-viral CRISPR/Cas9 delivery system for therapeutically targeting HBV DNA and pcsk9 in vivo. Cell. Res. 27(3), 440–443.
  21. Vader P., Mol E.A., Pasterkamp G., Schiffelers R.M. (2016) Extracellular vesicles for drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 106, 148–156.
  22. Doyle L.M., Wang M.Z. (2019) Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8(7), 727.
  23. Phillips W., Willms E., Hill A.F. (2021) Understanding extracellular vesicle and nanoparticle heterogeneity: novel methods and considerations. Proteomics. 21(13–14), e2000118.
  24. Alvarez-erviti L., Seow Y., Yin H., Betts C., Lakhal S., Wood M.J.A. (2011) Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat. Biotechnol. 29(4), 341–345.
  25. Yang B., Chen Y., Shi J. (2019) Exosome biochemistry and advanced nanotechnology for next-generation theranostic platforms. Adv. Mater. 31(2), e1802896.
  26. Kim M.S., Haney M.J., Zhao Y., Mahajan V., Deygen I., Klyachko N.L., Inskoe E., Piroyan A., Sokolsky M., Okolie O., Hingtgen S.D., Kabanov A.V., Batrakova E.V. (2016) Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR in cancer cells. Nanomedicine. 12(3), 655–664.
  27. Yuan D., Zhao Y., Banks W.A., Bullock K.M., Haney M., Batrakova E., Kabanov A.V. (2017) Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1–12.
  28. Kim H., Yun N., Mun D., Kang J.Y., Lee S.H., Park H., Park H., Joung B. (2018) Cardiac-specific delivery by cardiac tissue-targeting peptide-expressing exosomes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 499(4), 803–808.
  29. Brezgin S., Parodi A., Kostyusheva A., Ponomareva N., Lukashev A., Sokolova D., Pokrovsky V.S., Slatinskaya O., Maksimov G., Zamyatnin A.A. Jr., Chulanov V., Kostyushev D. (2023) Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles. Biotechnol. Adv. 64, 108122.
  30. Chen R., Huang H., Liu H., Xi J., Ning J., Zeng W., Shen C., Zhang T., Yu G., Xu Q., Chen X., Wang J., Lu F. (2019) Friend or foe? Evidence indicates endogenous exosomes can deliver functional gRNA and Cas9 protein. Small. 15(38), e1902686.
  31. Dai J., Su Y., Zhong S., Cong L., Liu B., Yang J., Tao Y., He Z., Chen C., Jiang Y. (2020) Exosomes : key players in cancer and potential therapeutic strategy. Signal. Transduct. Target. Ther. 5(1), 145.
  32. Kornilov R., Puhka M., Mannerström B., Hiidenmaa H., Peltoniemi H., Siljander P., Seppänen-Kaijansinkko R., Kaur S. (2018) Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J. Extracell. Vesicles. 7(1), 1422674.
  33. Hessvik N.P., Llorente A. (2018) Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cell. Mol. Life Sci. 75(2), 193–208.
  34. Ostrowski M., Carmo N.B., Krumeich S., Fanget I., Raposo G., Savina A., Moita C.F., Schauer K., Hume A.N., Freitas R.P., Goud B., Benaroch P., Hacohen N., Fukuda M., Desnos C., Seabra M.C., Darchen F., Amigorena S., Moita L.F., Thery C. (2009) Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretion pathway. Nat. Cell Biol. 12(1), 19–30.
  35. Gurung S., Perocheau D., Touramanidou L., Baruteau J. (2021) The exosome journey : from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Commun. Signal. 19(1), 47.
  36. Manders E.M., Verbeek F., Aten J. (1992) Measurement of co-localization of objects in dual colour confocal images. J. Microsc. 169, 375–382.
  37. Luo T., Mitra S., McBride J.W. (2018) Ehrlichia chaffeensis TRP75 interacts with host cell targets. mSphere. 3(2), e00147–18.
  38. Brezgin S., Kostyusheva A., Ponomareva N., Bayurova E., Kondrashova A., Frolova A., Slatinskaya O., Fatkhutdinova L., Maksimov G., Zyuzin M., Gordeychuk I., Lukashev A., Makarov S., Ivanov A., Zamyatnin A.A. Jr., Chulanov V., Parodi A., Kostyushev D. (2023) Hydroxychloroquine enhances cytotoxic properties of extracellular vesicles and extracellular vesicle – mimetic nanovesicles loaded with chemotherapeutics. Pharmaceutics. 15(2), 534.
  39. Théry C., Witwer K.W., Aikawa E., Alcaraz M.J., Anderson J.D., Andriantsitohaina R., Antoniou A., Arab T., Archer F., Atkin‐Smith G.K. (2018) Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for extracellular vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J. Extracell. Vesicles. 7(1), 1535750.
  40. Witwer K.W., Goberdhan D.C., O’Driscoll L., Théry C., Welsh J.A., Blenkiron C., Buzás E.I., Di Vizio D., Erdbrügger U., Falcón-Pérez J.M., Fu Q.L, Hill A.F., Lenassi M., Lötvall J., Nieuwland R., Ochiya T., Rome S., Sahoo S., Zheng L. (2021) Updating MISEV : Evolving the minimal requirements for studies of extracellular vesicles. J. Extracell. Vesicles. 10(14), e12182.
  41. Gee P., Lung M.S.Y., Okuzaki Y., Sasakawa N., Iguchi T., Makita Y., Hozumi H., Miura Y., Yang L.F., Iwasaki M., Wang X.H., Waller M.A., Shirai N., Abe Y.O., Fujita Y., Watanabe K., Kagita A., Iwabuchi K.A., Yasuda M., Xu H., Noda T., Komano J., Sakurai H., Inukai N., Hotta A. (2020) Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nat. Commun. 11(1), 1334.
  42. Liang X., Gupta D., Xie J., Wonterghem E., Van Hoecke L., Van Hean J., Niu Z., Wiklander O.P.B., Zheng W., Wiklander R.J., , Rui He, Doste R. Mamand, Bost J., Zhou G., Zhou H., Roudi S., Zickler A.M., Görgens A., Hagey D.W., de Jong O.G., Uy A. G., Zong Y., Mäger Imre., Perez C.M., Roberts T.C., Vader P., Vandenbroucke R.E., Nordin J.Z., EL-Andaloussiet S. (2023) Multimodal engineering of extracellular vesicles for efficient intracellular protein delivery. bioRxiv. 2023.04.30.535834. doi: 10.1101/2023.04.30.535834
  43. Li T., Zhang L., Lu T., Zhu T., Feng C., Gao N., Liu F., Yu J., Chen K., Zhong J., Tang Q., Zhang Q., Deng X., Ren J., Zeng J., Zhou H., Zhu J. (2023) Engineered extracellular vesicle-delivered CRISPR / CasRx as a novel RNA editing tool. Adv. Sci. (Weinh). 10(10), e2206517.
  44. Patel S., Kim J., Herrera M., Mukherjee A., Kabanov A.V., Sahay G. (2019) Brief update on endocytosis of nanomedicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 144, 90–111.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Трансфекция трансформированных и нетрансформированных клеток человека плазмидами CD63-EGFP и dCas9-BFP. а – График эффективности котрансфекции изучаемых линий клеток. б – Микрофотографии линий клеток, трансфицированных плазмидой CD63-EGFP. EGFP – зеленый флуоресцентный белок. BFP – синий флуоресцентный белок.

Скачать (416KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Оценка уровней колокализации белка dCas9-BFP с факторами биогенеза экзосом в линиях клеток HEK293T и HepG2. а – Репрезентативные конфокальные изображения клеток, трансфицированных dCas9-BFP с CD63-EGFP либо Rab27А-EGFP. В крайнем правом ряду представлены цитофлуорограммы светимости dCas9-BFP и CD63-GFP либо Rab27А-EGFP. б – Полуколичественные данные колокализации dCas9-BFP с белками CD63-EGFP и Rab27А-EGFP, рассчитанные с помощью коэффициента М1. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям.

Скачать (440KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Характеристика наночастиц. а – Анализ измерения размера экзосом методом динамического светорассеяния. d – Диаметр, нм. б – Распределение частиц по размеру. в – Анализ ζ-потенциала наночастиц. г – Вестерн-блот-анализ экспрессии белков CD63, CD81, Hsp70 в изолятах биологических наночастиц.

Скачать (153KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Оценка уровней стохастической упаковки белка Cas9 в экзосомы. а – Оценка доли EGFP-позитивных клеток методом проточной цитофлуориметрии. б – Гистограммы распределения сигнала EGFP в контрольных клетках и в клетках через 2 и 6 ч после добавления экзосом.

Скачать (207KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024