Способы повышения уровня нокина конструкции, кодирующей пептидный ингибитор слияния ВИЧ-1 MT-C34, в локус CXCR4 В Т-клеточной линии CEM/R5

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Низкая эффективность нокина генетических конструкций, особенно в первичных клетках человека, ограничивает применение технологии редактирования генома для терапевтических целей. Таким образом, остается актуальным поиск способов повышения нокина. В представленной работе на модели нокина конструкции, кодирующей пептидный ингибитор слияния ВИЧ-1 MT-C34, в локус CXCR4 человека в Т-клеточной линии CEM/R5 изучены возможности нескольких подходов к повышению эффективности этой технологии. В первую очередь оценена модификация донорной ДНК как способа повышения эффективности транспорта плазмид в ядро, а именно: введение в донорную плазмиду последовательностей DTS (DNA transporting sequence) вируса-40 обезьян (SV40) или сайтов связывания транскрипционного фактора NF-κB, влияние которых на уровень нокина было неизвестно. На использованной нами модели нокина в локус CXCR4 такая модификация оказалась неэффективной. Второй подход, заключавшийся в модификации нуклеазы Cas9 путем введения двух дополнительных сигналов ядерной локализации (NLS), позволил повысить уровень нокина на 30%. Наконец, блокировка репарации ДНК по пути негомологичного соединения концов с помощью ингибиторов ДНК-зависимой протеинкиназы вызывала повышение нокина в 1.8 раз. Комбинация двух последних подходов давала аддитивный эффект. Таким образом, с помощью увеличения числа NLS в белке Cas9 и ингибирования репарации ДНК по пути негомологичного соединения концов нам удалось значительно повысить уровень нокина конструкции, кодирующей пептидный ингибитор слияния ВИЧ-1, в клинически релевантный локус CXCR4, что может быть использовано для разработки эффективных генотерапевтических подходов к лечению ВИЧ-инфекции.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Д. С. Голубев

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334

Д. С. Комков

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук; Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334; Beer-Sheva, 8410501 Israel

М. В. Шепелев

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334

Д. В. Мазуров

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук; Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine, University of Minnesota

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334; Minneapolis, 55455 USA

Н. А. Круглова

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334

Список литературы

  1. Jinek M., East A., Cheng A., Lin S., Ma E., Doudna J. (2013) RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471. https://doi.org/10.7554/ELIFE.00471
  2. Jiang F., Doudna J.A. (2017) CRISPR–Cas9 structures and mechanisms. Annu. Rev. Biophys. 46, 505–529. https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-062215-010822
  3. Nambiar T.S., Baudrier L., Billon P., Ciccia A. (2022) CRISPR-based genome editing through the lens of DNA repair. Mol. Cell. 82, 348–388. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.12.026
  4. Li T., Yang Y., Qi H., Cui W., Zhang L., Fu X., He X., Liu M., Li P.F., Yu T. (2023) CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Signal. Transduct. Target Ther. 8, 36. https://doi.org/10.1038/s41392-023-01309-7
  5. Pavlovic K., Tristán-Manzano M., Maldonado-Pérez N., Cortijo-Gutierrez M., Sánchez-Hernández S., Justicia-Lirio P., Carmona M.D., Herrera C., Martin F., Benabdellah K. (2020) Using gene editing approaches to fine-tune the immune system. Front. Immunol. 11, 570672. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.570672
  6. Cornu T.I., Mussolino C., Müller M.C., Wehr C., Kern W.V., Cathomen T. (2021) HIV gene therapy: an update. Hum. Gene Ther. 32, 52–65. https://doi.org/10.1089/HUM.2020.159
  7. Liu M., Rehman S., Tang X., Gu K., Fan Q., Chen D., Ma W. (2019) Methodologies for improving HDR efficiency. Front. Genet. 9, 691. https://doi.org/10.3389/fgene.2018.00691
  8. Maslennikova A., Kruglova N., Kalinichenko S., Komkov D., Shepelev M., Golubev D., Siniavin A., Vzorov A., Filatov A., Mazurov D. (2022) Engineering T-cell resistance to HIV-1 infection via knock-in of peptides from the heptad repeat 2 domain of gp41. mBio. 13, e0358921. https://doi.org/10.1128/mbio.03589-21
  9. Dean D.A., Dean B.S., Muller S., Smith L.C. (1999) Sequence requirements for plasmid nuclear import. Exp. Cell Res. 253, 713–722. https://doi.org/10.1006/EXCR.1999.4716
  10. Bai H., Lester G.M.S., Petishnok L.C., Dean D.A. (2017) Cytoplasmic transport and nuclear import of plasmid DNA. Biosci. Rep. 37, BSR20160616. https://doi.org/10.1042/BSR20160616
  11. Vacik J., Dean B.S., Zimmer W.E., Dean D.A. (1999) Cell-specific nuclear import of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1006–1014. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300924
  12. Young J.L., Benoit J.N., Dean D.A. (2003) Effect of a DNA nuclear targeting sequence on gene transfer and expression of plasmids in the intact vasculature. Gene Ther. 10, 1465–1470. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3302021
  13. Mesika A., Grigoreva I., Zohar M., Reich Z. (2001) A regulated, NFκB-assisted import of plasmid DNA into mammalian cell nuclei. Mol. Ther. 3, 653–657. https://doi.org/10.1006/mthe.2001.0312
  14. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819–823. https://doi.org/10.1126/science.1231143
  15. Maggio I., Zittersteijn H.A., Wang Q., Liu J., Janssen J.M., Ojeda I.T., van der Maarel S.M., Lankester A.C., Hoeben R.C., Gonçalves M.A.F.V. (2020) Integrating gene delivery and gene-editing technologies by adenoviral vector transfer of optimized CRISPR-Cas9 components. Gene Ther. 27, 209–225. https://doi.org/10.1038/s41434-019-0119-y
  16. Shams F., Bayat H., Mohammadian O., Mahboudi S., Vahidnezhad H., Soosanabadi M., Rahimpour A. (2022) Advance trends in targeting homology-directed repair for accurate gene editing: an inclusive review of small molecules and modified CRISPR-Cas9 systems. BioImpacts. 12, 371–391. https://doi.org/10.34172/bi.2022.23871
  17. Makkerh J.P.S., Dingwall C., Laskey R.A. (1996) Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr. Biol. 6, 1025–1027. https://doi.org/10.1016/S0960-9822(02)00648-6
  18. Zotova A., Pichugin A., Atemasova A., Knyazhanskaya E., Lopatukhina E., Mitkin N., Holmuhamedov E., Gottikh M., Kuprash D., Filatov A., Mazurov D. (2019) Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositol-anchored epitope tags. Sci. Rep. 9, 3132. https://doi.org/10.1038/S41598-019-40219-Z
  19. Shin S., Kim S.H., Lee J.S., Lee G.M. (2021) Streamlined human cell-based recombinase-mediated cassette exchange platform enables multigene expression for the production of therapeutic proteins. ACS Synth. Biol. 10, 1715–1727. https://doi.org/10.1021/acssynbio.1c00113
  20. Nguyen D.N., Roth T.L., Li P.J., Chen P.A., Apathy R., Mamedov M.R., Vo L.T., Tobin V.R., Goodman D., Shifrut E., Bluestone J.A., Puck J.M., Szoka F.C., Marson A. (2020) Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency. Nat. Biotechnol. 38, 44–49. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0325-6
  21. Shy B.R., Vykunta V.S., Ha A., Talbot A., Roth T.L., Nguyen D.N., Pfeifer W.G., Chen Y.Y., Blaeschke F., Shifrut E., Vedova S., Mamedov M.R., Chung J.J., Li H., Yu R., Wu D., Wolf J., Martin T.G., Castro C.E., Ye L., Esensten J.H., Eyquem J., Marson A. (2023) High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat. Biotechnol. 41, 521–531. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01418-8
  22. Pinder J., Salsman J., Dellaire G. (2015) Nuclear domain 'knock-in’ screen for the evaluation and identification of small molecule enhancers of CRISPR-based genome editing. Nucleic Acids Res. 43, 9379–9392. https://doi.org/10.1093/nar/gkv993
  23. Kath J., Du W., Pruene A., Braun T., Thommandru B., Turk R., Sturgeon M.L., Kurgan G.L., Amini L., Stein M., Zittel T., Martini S., Ostendorf L., Wilhelm A., Akyüz L., Rehm A., Höpken U.E., Pruß A., Künkele A., Jacobi A.M., Volk H.D., Schmueck-Henneresse M., Stripecke R., Reinke P., Wagner D.L. (2022) Pharmacological interventions enhance virus-free generation of TRAC-replaced CAR T cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 25, 311–330. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2022.03.018
  24. Young J.L., Zimmer W.E., Dean D.A. (2008) Smooth muscle-specific gene delivery in the vasculature based on restriction of DNA nuclear import. Exp. Biol. Med. 233, 840–848. https://doi.org/10.3181/0712-RM-331
  25. Degiulio J.V., Kaufman C.D., Dean D.A. (2010) The SP-C promoter facilitates alveolar type II epithelial cell-specific plasmid nuclear import and gene expression. Gene Ther. 17, 541–549. https://doi.org/10.1038/gt.2009.166
  26. Schulze-Luehrmann J., Ghosh S. (2006) Antigen-receptor signaling to nuclear factor κB. Immunity. 25, 701–715. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2006.10.010
  27. Wu W., Nie L., Zhang L., Li Y. (2018) The notch pathway promotes NF-κB activation through Asb2 in T cell acute lymphoblastic leukemia cells. Cell. Mol. Biol. Lett. 23, 37. https://doi.org/10.1186/s11658-018-0102-4
  28. Castro-caldas M., Mendes A.F., Carvalho A.P., Duarte C.B., Lopes M.C. (2003) Dexamethasone prevents interleukin-1β-induced nuclear factor-κB activation by upregulating IκB-α synthesis, in lymphoblastic cells. Mediators Inflamm. 12, 37–46. https://doi.org/10.1080/0962935031000096953
  29. Remy S., Chenouard V., Tesson L., Usal C., Ménoret S., Brusselle L., Heslan J.M., Nguyen T.H., Bellien J., Merot J., De Cian A., Giovannangeli C., Concordet J.P., Anegon I. (2017) Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Sci. Rep. 7, 16554. https://doi.org/10.1038/s41598-017-16328-y
  30. Shui S., Wang S., Liu J. (2022) Systematic investigation of the effects of multiple SV40 nuclear localization signal fusion on the genome editing activity of purified SpCas9. Bioengineering. 9, 83. https://doi.org/10.3390/bioengineering9020083
  31. Fu Y.-W., Dai X.Y., Wang W.T., Yang Z.X., Zhao J.J., Zhang J.P., Wen W., Zhang F., Oberg K.C., Zhang L., Cheng T., Zhang X.B. (2021) Dynamics and competition of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and AAV donor-mediated NHEJ, MMEJ and HDR editing. Nucleic Acids Res. 49, 969–985. https://doi.org/10.1093/nar/gkaa1251
  32. Killian T., Dickopf S., Haas A.K., Kirstenpfad C., Mayer K., Brinkmann U. (2017) Disruption of diphthamide synthesis genes and resulting toxin resistance as a robust technology for quantifying and optimizing CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Sci. Rep. 7, 15480. https://doi.org/10.1038/s41598-017-15206-x
  33. Wienert B., Nguyen D.N., Guenther A., Feng S.J., Locke M.N., Wyman S.K., Shin J., Kazane K.R., Gregory G.L., Carter M.A.M., Wright F., Conklin B.R., Marson A., Richardson C.D., Corn J.E. (2020) Timed inhibition of CDC7 increases CRISPR-Cas9 mediated templated repair. Nat. Commun. 11, 2109. https://doi.org/10.1038/s41467-020-15845-1

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Дополнительный материал
Скачать (918KB)
Метаданные
3. Рис. 1. Дизайн конструкции для нокина MTC34 в экзон-2 гена CXCR4 (а) и схемы донорных конструкций с различными модификациями (б). 5'-HA – 5'-плечо гомологии; Р2А – сигнал пропуска рибосомы; LS – лидерная последовательность; GPI – последовательность для модификации пептида GPI-якорем; рА – сигнал полиаденилирования; 3'-HA – 3'-плечо гомологии; гРНК – РНК-гид; DTS – ДНК-транспортирующая последовательность; 4×NF-κB – 4 сайта связывания NF-κB, разделенные короткими линкерами.

Скачать (142KB)
Метаданные
4. Рис. 2. Уровень нокина MTC34 (а), нокаута CXCR4 (б) и соотношение нокин/нокаут (в) в клетках CEM/R5 при различном количестве донорной ДНК. Клетки электропорировали плазмидами pcDNA3.3-hCas9, pKS-gRNA-X4ex2 и донорной плазмидой pKS-don_MT-C34 и на 5 сутки после электропорации оценивали уровень нокаута CXCR4 и нокина MTC34 на поверхности клеток с помощью проточной цитофлуориметрии. KI/KO – соотношение нокина к нокауту. Результаты 3 независимых экспериментов представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD) и индивидуальные значения; значками разной формы обозначены независимые эксперименты. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

Скачать (142KB)
Метаданные
5. Рис. 3. Влияние DTS-сигналов в плазмидном доноре на уровень нокина. Уровень нокина MTC34 (а, б) и нокаута CXCR4 (в, г) в клетках CEM/R5. Клетки электропорировали плазмидами pcDNA3.3-hCas9, pKS-gRNA-X4ex2 и 1 пмоль донорной плазмиды pKS-don_MT-C34 без модификаций, с различным числом сигналов DTS (а, в) или различным числом и/или положением сайтов связывания NF-κB (б, г). На 5 сутки после электропорации оценивали уровень нокаута CXCR4 и нокина MTC34 на поверхности клеток с помощью проточной цитофлуориметрии. Результаты 3‒4 независимых экспериментов представлены как среднее ± SD и индивидуальные значения; значками разной формы обозначены независимые эксперименты. *p < 0.05, **p < 0.01.

Скачать (198KB)
Метаданные
6. Рис. 4. Влияние числа NLS в белке Cas9 на эффективность редактирования локуса CXCR4. а – Схемы конструкций на основе плазмиды pcDNA3.3-hCas9. Приведены аминокислотные последовательности NLS SV40 и последовательность второго оснóвного мотива из NLS нуклеоплазмина. Уровень нокина МТС34 (б), нокаута CXCR4 (в) и соотношение нокин/нокаут (г) в клетках CEM/R5, электропорированных одной из конструкций 1‒3 (а) вместе с плазмидами pKS-gRNA-X4ex2 и pKS-don_MT-C34. Уровень нокаута CXCR4 и нокина MTC34 оценивали методом проточной цитофлуориметрии на 5 сутки после электропорации. KI/KO – соотношение нокина к нокауту. Результаты 4 независимых экспериментов представлены как среднее ± SD и индивидуальные значения; значками разной формы обозначены независимые эксперименты. *p < 0.05, **p < 0.01. д – Анализ методом иммуноблотинга экспрессии белка Cas9 с разным числом NLS (0, 1 и 3) в клетках CEM/R5. Лизаты окрашивали антителами к HA-эпитопу (для детекции Cas9) и к α-тубулину (для контроля уровня общего белка в лизатах).

Скачать (215KB)
Метаданные
7. Рис. 5. Повышение уровня нокина за счет ингибирования механизма NHEJ и стимуляции HDR. а – Низкомолекулярные соединения, использованные в работе. Уровень нокина МТС34 (б), нокаута CXCR4 (в) и соотношение нокин/нокаут (г) в клетках CEM/R5. Клетки электропорировали плазмидами pcDNA3.3-hCas9, pKS-gRNA-X4ex2 и pKS-don_MT-C34, через 24 ч среду меняли на свежую, еще через 72 ч оценивали уровень нокаута CXCR4 и нокина MTC34 методом проточной цитофлуориметрии. KI/KO – соотношение нокина к нокауту. Результаты 3 независимых экспериментов приведены как среднее ± SD и индивидуальные значения; значками разной формы обозначены независимые эксперименты. *p < 0.05, ***p < 0.001.

Скачать (234KB)
Метаданные
8. Рис. 6. Повышение уровня нокина MTC34 за счет экспрессии Cas9-3×NLS и обработки клеток ингибитором DNA-PK. Уровень нокина МТС34 (а) и нокаута CXCR4 (б) в клетках CEM/R5, электропорированных плазмидами pKS-gRNA-X4ex2 и pKS-don_MT-C34, а также одной из плазмид pcDNA3.3-hCas9-1×NLS (1) или pcDNA3.3-hCas9-3×NLS (3). В течение 24 ч после электропорации клетки культивировали в присутствии М3814 (+) или в отсутствие (‒). На 5 сутки оценивали уровень нокаута CXCR4 и нокина MTC34 по экспрессии соответствующих белка CXCR4 и пептида MT-C34 на поверхности клеток методом проточной цитофлуориметрии. Результаты 4 независимых экспериментов представлены как среднее ± SD и индивидуальные значения; значками разной формы обозначены независимые эксперименты. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

Скачать (104KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024