Повышение уровня нокина МТ-С34-кодирующей конструкции в локус CXCR4 с помощью модификации донорной ДНК сайтами-мишенями Cas9

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Для успешного применения в клинической практике технологии редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 необходимо добиться высокой эффективности нокина, то есть встраивания генетической конструкции в заданное место генома клетки-мишени. Один из подходов к повышению эффективности нокина заключается в модификации донорной ДНК путем введения в нее тех же мишеней для Cas9 (Cas9 targeting sequence, CTS), которые используются для внесения двухцепочечного разрыва в геном клетки (метод “double-cut donor”). Другой подход основан на введении в донорную ДНК укороченных мишеней для Cas9 (truncated, tCTS), включающих сайт РАМ и 16 проксимальных к нему нуклеотидов, которые предположительно не должны вызывать расщепление донорной плазмиды, но способны стимулировать ее транспорт в ядро за счет Cas9. Однако точные механизмы повышения уровня нокина под действием обоих типов модификаций донорной ДНК неизвестны. Мы оценили влияние этих модификаций донорной ДНК на эффективность нокина конструкции, кодирующей пептидный ингибитор слияния ВИЧ-1 МТ-С34, в локус CXCR4 в Т-клеточной линии СЕМ/R5. При введении в донорную плазмидную ДНК полноразмерных CTS уровень нокина повышался в 2 раза вне зависимости от числа CTS или их положения относительно донорной последовательности. Модификации tCTS не влияли на уровень нокина. Установлено, что in vitro оба типа сайтов эффективно расщеплялись под действием Cas9. Для детального изучения механизма действия этих модификаций необходимо оценивать их процессинг in vitro и in vivo.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

М. В. Шепелев

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334

Д. С. Комковa

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук; Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334; Beer-Sheva, 8410501 Israel

Д. С. Голубев

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334

С. Е. Боровикова

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334

Д. В. Мазуров

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук; Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine, University of Minnesota

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334; Minneapolis, 55455 USA

Н. А. Круглова

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук; Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine, University of Minnesota

Автор, ответственный за переписку.
Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, Москва, 119334; Minneapolis, 55455 USA

Список литературы

  1. Doudna J.A. (2020) The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578, 229–236. https://doi.org/10.1038/s41586-020-1978-5
  2. Jiang F., Doudna J.A. (2017) CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu. Rev. Biophys. 46, 505–529. https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-062215-010822
  3. Antoniani C., Meneghini V., Lattanzi A., Felix T., Romano O., Magrin E., Weber L., Pavani G., El Hoss S., Kurita R., Nakamura Y., Cradick T.J., Lundberg A.S., Porteus M., Amendola M., El Nemer W., Cavazzana M., Mavilio F., Miccio A. (2018) Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human β-globin locus. Blood. 131, 1960–1973. https://doi.org/10.1182/blood-2017-10-811505
  4. Pavlovic K., Tristán-Manzano M., Maldonado-Pérez N., Cortijo-Gutierrez M., Sánchez-Hernández S., Justicia-Lirio P., Carmona M.D., Herrera C., Martin F., Benabdellah K. (2020) Using gene editing approaches to fine-tune the immune system. Front. Immunol. 11, 570672. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.570672
  5. Kotagama O.W., Jayasinghe C.D., Abeysinghe T. (2019) Era of genomic medicine: a narrative review on CRISPR technology as a potential therapeutic tool for human diseases. Biomed. Res. Int. 2019, 1369682. https://doi.org/10.1155/2019/1369682
  6. Sun W., Liu H., Yin W., Qiao J., Zhao X., Liu Y. (2022) Strategies for enhancing the homology-directed repair efficiency of CRISPR-Cas systems. CRISPR J. 5, 7–18. https://doi.org/10.1089/crispr.2021.0039
  7. Shams F., Bayat H., Mohammadian O., Mahboudi S., Vahidnezhad H., Soosanabadi M., Rahimpour A. (2022) Advance trends in targeting homology-directed repair for accurate gene editing: an inclusive review of small molecules and modified CRISPR-Cas9 systems. Bioimpacts. 12, 371–391. https://doi.org/10.34172/bi.2022.23871
  8. Smirnikhina S.A., Zaynitdinova M.I., Sergeeva V.A., Lavrov A.V. (2022) Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int. J. Mol. Sci. 23, 5992. https://doi.org/10.3390/ijms23115992
  9. Richardson C.D., Ray G.J., DeWitt M.A., Curie G.L., Corn J.E. (2016) Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat. Biotechnol. 34, 339–344. https://doi.org/10.1038/nbt.3481
  10. Zhang J.P., Li X.L., Li G.H., Chen W., Arakaki C., Botimer G.D., Baylink D., Zhang L., Wen W., Fu Y.W., Xu J., Chun N., Yuan W., Cheng T., Zhang X.B. (2017) Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18, 35. https://doi.org/10.1186/S13059-017-1164-8
  11. Ghanta K.S., Chen Z., Mir A., Dokshin G.A., Krishnamurthy P.M., Yoon Y., Gallant J., Xu P., Zhang X.O., Ozturk A.R., Shin M., Idrizi F., Liu P., Gneid H., Edraki A., Lawson N.D., Rivera-Pérez J.A., Sontheimer E.J., Watts J.K., Mello C.C. (2021) 5′-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing. Elife. 10, e72216. https://doi.org/10.7554/eLife.72216
  12. Haraguchi T., Koujin T., Shindo T., Bilir Ş., Osakada H., Nishimura K., Hirano Y., Asakawa H., Mori C., Kobayashi S., Okada Y., Chikashige Y., Fukagawa T., Shibata S., Hiraoka Y. (2022) Transfected plasmid DNA is incorporated into the nucleus via nuclear envelope reformation at telophase. Commun. Biol. 5, 78. https://doi.org/10.1038/s42003-022-03021-8
  13. Carlson-Stevermer J., Abdeen A.A., Kohlenberg L., Goedland M., Molugu K., Lou M., Saha K. (2017) Assembly of CRISPR ribonucleoproteins with biotinylated oligonucleotides via an RNA aptamer for precise gene editing. Nat. Commun. 8, 1711.https://doi.org/10.1038/s41467-017-01875-9
  14. Ma M., Zhuang F., Hu X., Wang B., Wen X.Z., Ji J.F., Xi J.J. (2017) Efficient generation of mice carrying homozygous double-floxp alleles using the Cas9-Avidin/Biotin-donor DNA system. Cell Res. 27, 578–581. https://doi.org/10.1038/cr.2017.29
  15. Savic N., Ringnalda F.C., Lindsay H., Berk C., Bargsten K., Li Y., Neri D., Robinson M.D., Ciaudo C., Hall J., Jinek M., Schwank G. (2018) Covalent linkage of the DNA repair template to the CRISPR-Cas9 nuclease enhances homology-directed repair. Elife. 7, e33761.https://doi.org/10.7554/eLife.33761
  16. Aird E.J., Lovendahl K.N., St. Martin A., Harris R.S., Gordon W.R. (2018) Increasing Cas9-mediated homology-directed repair efficiency through covalent tethering of DNA repair template. Commun. Biol. 1, 54. https://doi.org/10.1038/s42003-018-0054-2
  17. Nguyen D.N., Roth T.L., Li P.J., Chen P.A., Apathy R., Mamedov M.R., Vo L.T., Tobin V.R., Goodman D., Shifrut E., Bluestone J.A., Puck J.M., Szoka F.C., Marson A. (2020) Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency. Nat. Biotechnol. 38, 44–49. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0325-6
  18. Zhang J.P., Li X.L., Neises A., Chen W., Hu L.P., Ji G.Z., Yu J.Y., Xu.J, Yuan W.P., Cheng T., Zhang X.B. (2016) Different effects of sgRNA length on CRISPR-mediated gene knockout efficiency. Sci. Rep. 6, 28566. https://doi.org/10.1038/srep28566
  19. Shy B.R., Vykunta V.S., Ha A., Talbot A., Roth T.L., Nguyen D.N., Pfeifer W.G., Chen Y.Y., Blaeschke F., Shifrut E., Vedova S., Mamedov M.R., Chung J.J., Li H., Yu R., Wu D., Wolf J., Martin T.G., Castro C.E., Ye L., Esensten J.H., Eyquem J., Marson A. (2023) High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat. Biotechnol. 41, 521–531. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01418-8
  20. Kath J., Du W., Pruene A., Braun T., Thommandru B., Turk R., Sturgeon M.L., Kurgan G.L., Amini L., Stein M., Zittel T., Martini S., Ostendorf L., Wilhelm A., Akyüz L., Rehm A., Höpken U.E., Pruß A., Künkele A., Jacobi A.M., Volk H.D., Schmueck-Henneresse M., Stripecke R., Reinke P., Wagner D.L. (2022) Pharmacological interventions enhance virus-free generation of TRAC-replaced CAR T cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 25, 311–330. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2022.03.018
  21. Oh S.A., Senger K., Madireddi S., Akhmetzyanova I., Ishizuka I.E., Tarighat S., Lo J.H., Shaw D., Haley B., Rutz S. (2022) High-efficiency nonviral CRISPR/Cas9-mediated gene editing of human T cells using plasmid donor DNA. J. Exp. Med. 219, e20211530. https://doi.org/10.1084/jem.20211530
  22. Lin-Shiao E., Pfeifer W.G., Shy B.R., Saffari Doost M., Chen E., Vykunta V.S., Hamilton J.R., Stahl E.C., Lopez D.M., Sandoval Espinoza C.R., Deyanov A.E., Lew R.J., Poirer M.G., Marson A., Castro C.E., Doudna J.A. (2022) CRISPR-Cas9-mediated nuclear transport and genomic integration of nanostructured genes in human primary cells. Nucleic Acids Res. 50, 1256–1268.https://doi.org/10.1093/nar/gkac049
  23. Maslennikova A., Kruglova N., Kalinichenko S., Komkov D., Shepelev M., Golubev D., Siniavin A., Vzorov A., Filatov A., Mazurov D. (2022) Engineering T-cell resistance to HIV-1 infection via knock-in of peptides from the heptad repeat 2 domain of gp41. mBio. 13, e0358921. https://doi.org/10.1128/mbio.03589-21
  24. Sternberg S.H., Redding S., Jinek M., Greene E.C., Doudna J.A. (2014) DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507, 62–67. https://doi.org/10.1038/nature13011
  25. Jing R., Jiao P., Chen J., Meng X., Wu X., Duan Y., Shang K., Qian L., Huang Y., Liu J., Huang T., Jin J., Chen W., Zeng X., Yin W., Gao X., Zhou C., Sadelain M., Sun J. (2021) Cas9-cleavage sequences in size-reduced plasmids enhance nonviral genome targeting of CARs in primary human T cells. Small Methods. 5, e2100071.https://doi.org/10.1002/smtd.202100071
  26. Aldag P., Welzel F., Jakob L., Schmidbauer A., Rutkauskas M., Fettes F., Grohmann D., Seidel R. (2021). Probing the stability of the SpCas9–DNA complex after cleavage. Nucleic Acids Res. 49, 12411–12421.https://doi.org/10.1093/nar/gkab1072
  27. Zou R., Liu Y., Ha T. (2021) In vitro cleavage and electrophoretic mobility shift assays for very fast CRISPR. Bio Protoc. 11, e4138. https://doi.org/10.21769/BioProtoc.4138
  28. Liu Y., Zou R.S., He S., Nihongaki Y., Li X., Razavi S., Wu B., Ha T. (2020) Very fast CRISPR on demand. Science. 368, 1265–1269. https://doi.org/10.1126/science.aay8204
  29. Fu Y., Sander J.D., Reyon D., Cascio V.M., Joung J.K. (2014) Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat. Biotechnol. 32, 279.https://doi.org/10.1038/NBT.2808

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема донорной конструкции для нокина MTC34 в экзон-2 локуса CXCR4 (а) и ее модификаций (б, в). Обозначения: 5ʹ-HA – 5ʹ-плечо гомологии; Р2А – сигнал пропуска рибосомы; LS – лидерная последовательность; GPI – последовательность для модификации пептида GPI-якорем; рА – сигнал полиаденилирования; 3ʹ-HA – 3ʹ-плечо гомологии. б – Схематичное изображение плазмид, несущих CTS на 5ʹ- или 3ʹ- конце донорной ДНК (перед 5ʹ-HA или после 3ʹ-НА соответственно); в – последовательности CTS и tCTS. 0MM – в протоспейсере нет некомплементарных оснований; 4MM, 6MM и 8MM – на 5ʹ-конце протоспейсера находятся соответственно 4, 6 или 8 некомплементарных оснований. Сайт РАМ показан жирным шрифтом, протоспейсер подчеркнут, некомплементарные основания в его составе подчеркнуты пунктирной линией. Здесь: CTS – таргетная последовательность Cas9, соответствующая протоспейсеру вместе с РАМ; tCTS – таргетная последовательность Cas9, соответствующая протоспейсеру с некомплементарными основаниями.

Скачать (144KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Влияние CTS-модификаций донорной ДНК на уровень нокина МТС34 (а), нокаута CXCR4 (б) и соотношения нокин/нокаут (в) в клетках CEM/R5. Клетки электропорировали плазмидами pcDNA3.3-hCas9, pKS-gRNA-X4ex2 и одним из вариантов донорной плазмиды pKS-don_MT-C34, на 5 сутки оценивали уровень нокаута (KO) CXCR4 и нокина (KI) MTC34 по экспрессии соответствующих белка CXCR4 и пептида MT-C34 на поверхности клеток с помощью проточной цитофлуориметрии. KI/KO – соотношение нокина к нокауту; контроль (‒) – донорная плазмида pKS-don_MT-C34 без модификаций; (0, 4, 6, 8) ММ – число некомплементарных оснований в протоспейсере CTS. Приведены средние значения ± стандартное отклонение (SD) и отдельные результаты трех независимых экспериментов. *p < 0.01, **p < 0.0001.

Скачать (249KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Расщепление CTS-сайтов под действием Cas9 in vitro. Донорные плазмиды с CTS-сайтами, содержащими 0, 4, 6 или 8 некомплементарных оснований, а также донорную плазмиду без модификаций (‒CTS) инкубировали in vitro с комплексом Cas9 и гРНК против CXCR4 (гРНК-X4) (а) или контрольной (гРНК-Scr) (б) и оценивали уровень расщепления плазмиды с помощью электрофореза в 1%-ном ТАЕ-агарозном геле. Условные обозначения: r (relaxed) – релаксированная форма плазмиды, sc (super-coiled) – суперскрученная форма, d – фрагмент ~1 400 п. н. с донорной последовательностью, фланкированный CTS- или tCTS-сайтами. Донорные плазмиды с CTS-сайтами, содержащими 0 (в) или 4 (г) некомплементарных оснований, инкубировали in vitro с возрастающим количеством РНП и оценивали уровень расщепления плазмиды с помощью электрофореза в 1%-ном ТАЕ-агарозном геле. РНП/плазмида – молярное соотношение РНП к плазмидной ДНК. М – маркеры длины ДНК: 10 000, 8 000, 6 000, 5 000, 4 000, 3 500, 3 000, 2 500, 2 000, 1 500, 1 000, 750 п. н. (#SM1163; “Thermo Fisher Scientific”, США).

Скачать (187KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024