Метод индуцируемого нокдауна существенных для развития генов в культуре клеток OSC Drosophila melanogaster

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Предложен основанный на РНК-интерференции метод индуцируемого нокдауна генов, существенных для поддержания гомеостаза, в культуре клеток. В подходе используется встроенная в геном с помощью CRISPR-Cas9-мутагенеза конструкция, в которой экспрессия предшественника siРНК находится под контролем индуцируемого ионами меди металлотионеинового промотора. Эндогенный источник siРНК позволяет осуществить нокдаун в культурах клеток, которые имеют низкую эффективность трансфекции экзогенными siРНК. Эффективность подхода продемонстрирована на культуре соматических клеток яичников дрозофилы на двух генах, которые необходимы для оогенеза: Cul3, кодирующего компонент убиквитин-лигазного комплекса со множественными функциями в протеостазе, и cut, кодирующего фактор транскрипции, участвующий в регуляции дифференцировки фолликулярных клеток яичников.

Ключевые слова

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

С. В. Марфина

Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”; Российский химико-технологический университет им Д.И. Менделеева

Email: n.akulenko11@gmail.com
Россия, Москва, 123182; Москва 125047

Е. А. Михалева

Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”

Email: n.akulenko11@gmail.com
Россия, Москва, 123182

Н. В. Акуленко

Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”

Автор, ответственный за переписку.
Email: n.akulenko11@gmail.com
Россия, Москва, 123182

С. С. Рязанский

Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”

Email: s.ryazansky@gmail.com
Россия, Москва, 123182

Список литературы

  1. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, 819–823.
  2. Mali P., Yang L., Esvelt K.M., Aach J., Guell M., DiCarlo J.E., Norville J.E., Church G.M. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823–826.
  3. Mohr S., Smith J., Shamu C., Neumüller R., Perrimon N. (2014) RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 15, 591–600.
  4. Ni J.-Q., Zhou R., Czech B., Liu L.P., Holderbaum L., Yang-Zhou D., Shim H.S., Tao R., Handler D., Karpowicz P., Binari R., Booker M., Brennecke J., Perkins L.A., Hannon G.J., Perrimon N. (2011) A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nat. Methods. 8, 405–407.
  5. Gilbert L.A., Larson M.H., Morsut L., Liu Z., Brar G.A., Torres S.E., Stern-Ginossar N., Brandman O., Whitehead E.H., Doudna J.A., Lim W.A., Weissman J.S., Qi L.S. (2013) CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442–451.
  6. Xu X., Qi L.S. (2019) A CRISPR–dCas toolbox for genetic engineering and synthetic biology. J. Mol. Biol. 431, 34–47.
  7. Kordyś M., Sen R., Warkocki Z. (2022) Applications of the versatile CRISPR-Cas13 RNA targeting system. WIREs RNA. 13, e1694.
  8. Scharf I., Bierbaumer L., Huber H., Wittmann P., Haider C., Pirker C., Berger W., Mikulits W. (2018) Dynamics of CRISPR/Cas9-mediated genomic editing of the AXL locus in hepatocellular carcinoma cells. Oncol. Lett. 15, 2441–2450.
  9. Boettcher M., McManus M.T. (2015) Choosing the right tool for the job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol. Cell. 58, 575–585.
  10. Housden B.E., Muhar M., Gemberling M., Gersbach C.A., Stainier D.Y.R., Seydoux G., Mohr S.E., Zuber J., Perrimon N. (2017) Loss-of-function genetic tools for animal models: cross-species and cross-platform differences. Nat. Rev. Genet. 18, 24–40.
  11. Chong Z.X., Yeap S.K., Ho W.Y. (2021) Transfection types, methods and strategies: a technical review. Peer J. 9, e11165.
  12. Harper J.W., Schulman B.A. (2021) Cullin-RING ubiquitin ligase regulatory circuits: a quarter century beyond the F-box hypothesis. Annu. Rev. Biochem. 90, 403‒429.
  13. Sun J., Deng W.-M. (2005) Notch-dependent downregulation of the homeodomain gene cut is required for the mitotic cycle/endocycle switch and cell differentiation in Drosophila follicle cells. Development. 132, 4299–4308.
  14. Knapp E.M., Li W., Sun J. (2019) Downregulation of homeodomain protein Cut is essential for Drosophila follicle maturation and ovulation. Development. 146, dev179002.
  15. Bassett A.R., Tibbit C., Ponting C.P., Liu J.-L. (2014) Mutagenesis and homologous recombination in Drosophila cell lines using CRISPR/Cas9. Biol. Open. 3, 42–49.
  16. Niki Y., Yamaguchi T., Mahowald A.P. (2006) Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 16325–16330.
  17. Gratz S.J., Ukken F.P., Rubinstein C.D., Thiede G., Donohue L.K., Cummings A.M., OꞌConnor-Giles K.M. (2014) Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196, 961–971.
  18. Kunzelmann S., Böttcher R., Schmidts I., Förstemann K. (2016) A comprehensive toolbox for genome editing in cultured Drosophila melanogaster cells. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6, 1777–1785.
  19. Böttcher R., Hollmann M., Merk K., Nitschko V., Obermaier C., Philippou-Massier J., Wieland I., Gaul U., Förstemann K. (2014) Efficient chromosomal gene modification with CRISPR/cas9 and PCR-based homologous recombination donors in cultured Drosophila cells. Nucl. Acids Res. 42, e89–e89.
  20. Perkins L.A., Holderbaum L., Tao R., Hu Y., Sopko R., McCall K., Yang-Zhou D., Flockhart I., Binari R., Shim H.S., Miller A., Housden A., Foos M., Randkelv S., Kelley C., Namgyal P., Villalta C., Liu L.P., Jiang X., Huan-Huan Q., Wang X., Fujiyama A., Toyoda A., Ayers K., Blum A., Czech B., Neumuller R., Yan D., Cavallaro A., Hibbard K., Hall D., Cooley L., Hannon G.J., Lehmann R., Parks A., Mohr S.E., Ueda R., Kondo S., Ni J.Q., Perrimon N. (2015) The transgenic RNAi project at Harvard medical school: resources and validation. Genetics. 201, 843–852.
  21. Sytnikova Y.A., Rahman R., Chirn G.-W., Clark J.P., Lau N.C. (2014) Transposable element dynamics and PIWI regulation impacts lncRNA and gene expression diversity in Drosophila ovarian cell cultures. Genome Res. 24, 1977–1990.
  22. Stoyko D., O T., Hernandez A., Konstantinidou P., Meng Q., Haase A.D. (2022) CRISPR-Cas9 genome editing and rapid selection of cell pools. Curr. Protoc. 2, e624.
  23. Xia B., Amador G., Viswanatha R., Zirin J., Mohr S.E., Perrimon N. (2020) CRISPR-based engineering of gene knockout cells by homology-directed insertion in polyploid Drosophila S2R+ cells. Nat. Protoc. 15, 3478–3498.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Результаты нокаута генов Cul3 и EloB в OSC. Изменение уровня экспрессии генов Cul3 и EloB в нокаутных клетках относительно исходной линии OSC[Cas9+] (а). Уровень экспрессии, измеренный методом qRT-ПЦР, нормировали на экспрессию rp49. Показаны средние значения измерений по двум биологическим повторностям с тремя техническими повторностями в каждом; погрешности измерения показаны стандартной ошибкой среднего. Статистическую значимость различий оценивали по методу Уилкоксона. ПЦР-анализ генома клеток Cul3-KO (б) и EloB-KO (в) показал наличие в обеих линиях как аллелей дикого типа, так и мутантного аллеля со вставкой гена hyg. Показана схема расположения использованных праймеров к последовательности генов, размер ампликонов и результат ПЦР (электрофорез в агарозном геле).

Скачать (150KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Схема конструирования донорной плазмиды pAc-MT-shRNA-bsd, содержащей кассету MT-shRNA-bsd с индуцируемой shРНК (а). Подробное описание представлено в тексте и разделе Экспериментальная часть. puro_R и puro_L ‒ фрагменты гена puro в pAc-MT-shRNA-bsd, которые будут служить плечами для гомологичной рекомбинации. Кассета MT-shRNA-bsd из донорной плазмиды внедряется в предварительно встроенный в геном трансген pAc-sgRNA-Cas9 (показана его часть с генами puro и Cas9) с помощью Cas9 и активируется добавлением ионов меди (б). Экспрессирующиеся shРНК процессируются до siРНК, которые в комплексе с белком Ago2 дрозофилы связываются с комплементарной мРНК и вызывают ее расщепление по механизму РНКи.

Скачать (288KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Изменение уровня экспрессии генов Cul3 (а) и cut (б) при добавлении ионов меди в концентрации 0.5, 1 и 2 мМ к линиям клеток, в геном которых внедрены кассеты с соответствующими shРНК, по сравнению с экспрессией в OSC[Cas9+]. Уровень экспрессии, измеренный методом qRT-ПЦР, нормировали на экспрессию rp49. Показаны средние значения измерений по двум-трем биологическим повторностям с тремя техническими повторностями в каждом; погрешности измерения показаны стандартной ошибкой среднего. Статистическую значимость различий оценивали по методу Уилкоксона; ns ‒ различия средних статистически недостоверны.

Скачать (137KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024