Том 57, № 3 (2023)

Успехи геномного редактирования сельскохозяйственных культур с использованием системы CRISPR/Cas в большой степени зависят от правильного выбора генов-мишеней, направленные изменения в которых позволят повысить урожайность, улучшить качество растительного сырья и устойчивость к биотическим и абиотическим стрессирующим факторам. В настоящей работе систематизированы и каталогизированы сведения о генах-мишенях, использованных для улучшения культурных растений. В последнем систематическом обзоре рассмотрены статьи, индексируемые в базе данных Scopus, опубликованные на 17.08.2019 г. В нашей работе охвачен период с 18.08.2019 по 15.03.2022 гг. Поиск по заданному алгоритму позволил выявить 2090 статей, среди которых только 685 содержат результаты редактирования генов 28 видов культурных растений (поиск проведен по 56 культурам). В значительной части этих публикаций рассмотрено либо редактирование генов-мишеней, проведенное ранее в аналогичных работах, либо исследования относились к сфере обратной генетики, и только 136 статей содержат данные о редактировании новых генов-мишеней, модификация которых направлена на улучшение селекционно значимых признаков растений. Всего за весь период применения системы CRISPR/Cas с целью улучшения селекционно значимых свойств редактированию были подвергнуты 287 генов-мишеней культурных растений. В настоящем обзоре представлен подробный анализ редактирования новых генов-мишеней. Чаще всего целью этих работ было повышение урожайности и устойчивости растений к болезням, а также улучшение свойств растительного сырья. Отмечено, удалось ли на момент публикации получить стабильные трансформанты, применялось ли редактирование к немодельным сортам. Существенно расширен спектр модифицированных сортов ряда культур, в частности, пшеницы, риса, сои, томата, картофеля, рапса, винограда, кукурузы. В подавляющем большинстве случаев редактирующие конструкции доставляли с использованием агробактериальной трансформации, реже – биобаллистики, трансфекции протопластов и гаплоиндукторов. Желаемого изменения признаков чаще всего удавалось достичь при помощи нокаута генов. В отдельных случаях осуществляли нокдаун и замены нуклеотидов в гене-мишени. Для получения нуклеотидных замен в генах культурных растений все чаще используют редактирование отдельных оснований (base-editing) и технологию поиска и замены (prime-editing). Появление удобной системы редактирования CRISPR/Cas способствовало развитию молекулярной частной генетики многих культурных видов растений.

Ключевую роль гистондеацетилаз (HDAC) в регуляции клеточного ответа на заражение вирусом гепатита С (HCV) впервые продемонстрировали в 2008 году. Изучая метаболизм железа в тканях печени больных хроническим гепатитом С, обнаружили, что в условиях окислительного стресса, вызванного вирусной инфекцией, в гепатоцитах заметно снижается экспрессия гена гепсидина (HAMP), гормона-регулятора экспорта железа. В схему регуляции экспрессии гепсидина оказались вовлечены HDAC, контролирующие уровень ацетилирования гистонов и транскрипционных факторов, прежде всего STAT3, ассоциированных с промотором HAMP. В настоящем обзоре обобщены современные данные о функционировании регуляторного контура HCV-HDAC3-STAT3-HAMP как пример хорошо охарактеризованного взаимодействия вируса и эпигенетического аппарата клетки-хозяина.

Вирус радужной окраски беспозвоночных 6 (IIV6) относится к роду Iridovirus в семействе Iridoviridae. Полностью секвенированный двухцепочечный ДНК-геном, состоящий из 212 482 п.н., кодирует 215 потенциальных открытых рамок считывания (ORF). Предполагают, что ORF 458R кодирует миристоилированный мембранный белок. Анализ экспрессии ORF458R в присутствии ингибиторов репликации ДНК и синтеза белка показал, что транскрипция этого гена начинается на поздней фазе вирусного инфекционного цикла. По результатам временнóго анализа транскрипция гена ORF458R инициируется в интервале 12‒24 ч после инфекции и затем ее интенсивность начинает снижаться. Транскрипция ORF458R инициируется на 53 нуклеотида выше сайта начала трансляции и заканчивается через 40 нуклеотидов после стоп-кодона. По результатам двойного люциферазного теста сделан вывод, что последовательность между ‒61 и +18 нуклеотидами необходима для активности промотора. Интересно заметное снижение активности промотора в присутствии последовательности, находящейся между ‒299 и ‒143 нуклеотидами, из чего можно предположить наличие репрессорной активности в этой области. Нами показано, что ORF458R ‒ транскрипционно активная и отдельно расположенная последовательность, в восходящей области которой локализованы регуляторные участки: промоторный и репрессорный. Надеемся, что полученная нами информация по структурной организации ORF458R позволит лучше понять молекулярные механизмы репликации IIV6.

МикроРНК, участвующие в регуляции экспрессии генов, вовлечены в патогенез широкого спектра многофакторных заболеваний, в том числе атеросклероза, его факторов риска и осложнений, что делает актуальным изучение функционально значимых полиморфных вариантов в генах микроРНК у пациентов с клинически выраженным атеросклерозом сонных артерий. Нами проведено секвенирование экзомов и микроРНК из одних и тех же образцов атеросклеротических бляшек сонных артерий мужчин (n = 8, возраст 66‒71 лет) с клинически выраженным атеросклерозом. В подтверждающем исследовании использовали расширенную выборку из 112 пациентов и 72 индивидов контрольной группы (этнических славян, жителей Западной Сибири). В образцах сонных артерий, пораженных атеросклерозом, обнаружены 206 пре-микроРНК и 76 зрелых микроРНК, содержащих 321 и 97 однонуклеотидных вариантов (SNV) соответственно. Объединение данных секвенирования экзомов и микроРНК показало, что 18 генов микроРНК, которые экспрессируются в атеросклеротических бляшках до зрелого состояния, несут 24 SNV. Из них наибольшей потенциальной функциональной значимостью в отношении экспрессии микроРНК, предсказанной in silico, обладали варианты rs2910164:C>G (MIR146A), rs2682818:A>C (MIR618), rs3746444:A>G (MIR499A), rs776722712:C>T (MIR186) и rs199822597:G>A (MIR363). В образцах, полученных от пациентов с генотипом АС rs2682818 гена MIR618, выявлено снижение уровня экспрессии miR-618 по сравнению с генотипом СС (log₂ FC = 4.8; p = 0.012). Обнаружено, что rs2910164:C (MIR146A) ассоциирован с риском развития клинически выраженного атеросклероза сонных артерий (OR = 2.35; 95%CI: 1.43‒3.85; p = 0.001). Интегративный подход позволил выявить новые наиболее информативные с точки зрения предсказания функциональной значимости полиморфные варианты в генах микроРНК. Вариант rs2682818:A>C (MIR618) может быть связан с изменением экспрессии miR-618 в атеросклеротических бляшках сонных артерий, а rs2910164:C (MIR146A) ассоциирован с риском развития клинически выраженного атеросклероза.

Неходжкинские лимфомы (НХЛ) представляют собой гетерогенную группу онкологических заболеваний, различающихся по патогенезу и прогнозу. К основным методам лечения НХЛ относятся химиотерапия, иммунохимиотерапия и лучевая терапия. Однако значительная часть этих опухолей отличается химиорезистентностью или быстрым рецидивированием после непродолжительной ремиссии, индуцированной химиотерапией. В связи с этим актуален поиск альтернативных терапевтических циторедуктивных методов. Аберрантная экспрессия микроРНК (miРНК) ‒ один из механизмов возникновения и опухолевой прогрессии злокачественных лимфоидных неоплазий. Мы проанализировали профиль экспрессии miРНК в биопсийном материале лимфоузлов, пораженных диффузной B-крупноклеточной лимфомой (DLBCL). Ключевым материалом исследования стали гистологические препараты лимфатических узлов, полученные в результате эксцизионной диагностической биопсии и обработанные с использованием классических гистоморфологических методов фиксации в формалине. Группу исследования составили пациенты с DLBCL (n = 52), а контрольную – пациенты с реактивной лимфоаденопатией (RL) (n = 40). Показано, что в DLBCL уровень экспрессии miR-150 снижен более чем в 12 раз (p = 3.6 × 10^‒15) в сравнении с RL. Биоинформационный анализ выявил участие miR-150 в регуляции гемопоэза и лимфопоэза. Полученные данные позволяют рассматривать miR-150 в качестве перспективной терапевтической мишени, обладающей большим потенциалом в клинической практике.

Ангиопоэтин-подобный белок 4 (ANGPTL4) считается одним из важных циркулирующих медиаторов, связывающих кишечные микроорганизмы с метаболизмом липидов хозяйского организма. В представленной работе изучено влияние рецептора-γ, активируемого пролифератором пероксисом (PPARγ) на модуляцию синтеза ANGPTL4 в клетках Caco-2, обработанных Clostridium butyricum. Жизнеспособность клеток Caco-2 и экспрессию в них PPARγ и ANGPTL4 определяли после cокультивирования с клетками C. butyricum в концентрации 1 × 10⁶, 1 × 10⁷ и 1 × 10⁸ КОЕ/мл. Показано повышение жизнеспособности клеток в присутствии C. butyricum. Кроме того, экспрессия и секреция PPARγ и ANGPTL4 в клетках Caco-2 значительно возрастали в присутствии 1 × 10⁷ и 1 × 10⁸ КОЕ/мл C. butyricum. Более того, влияние PPARγ на модуляцию синтеза ANGPTL4 в клетках Caco-2, обработанных 1 × 10⁸ КОЕ/мл C. butyricum, проверено также на модели активации/ингибирования PPARγ в клетках Caco-2 и с использованием метода иммунопреципитации хроматина (ChIP). Обнаружено, что C. butyricum стимулирует взаимодействие PPARγ с сайтом связывания PPAR, локализованным перед сайтом старта транскрипции гена angptl4 (chr19: 8362157-8362357) в клетках Caco-2. Однако PPARγ это не единственный путь стимуляции продукции ANGPTL4 под действием C. butyricum. В целом, PPARγ участвует в регуляции синтеза ANGPTL4 в клетках Caco-2, обработанных C. butyricum.

Противодействие распространению новых респираторных инфекций и снижение ущерба, наносимого ими обществу, требует разработки способов быстрого создания средств направленной терапии, таких как моноклональные антитела и подобные им структуры. Нанотела ‒ антигенраспознающие фрагменты особых антител Верблюдовых, состоящие из тяжелых цепей, ‒ обладают рядом характеристик, которые делают их применение наиболее удобным. Высокие темпы распространения пандемии COVID-19, вызванной новым коронавирусом ‒ SARS-CoV-2, ‒ указывают на то, что ключевым фактором в разработке средств терапии является быстрота получения высокоэффективных блокирующих антител, а также разнообразие эпитопов, с которыми эти антитела связываются. Мы провели оптимизацию процесса селекции нанотел из генетического материала животных семейства Верблюдовых и получили панель вариантов, обладающих сродством к белку шипа (S-белку) SARS-CoV-2 в нижнем наномолярном и пикомолярном диапазоне и высокой специфичностью связывания. В экспериментах in vitro и in vivo были отобраны нанотела, блокирующие взаимодействие между S-белком и клеточным рецептором SARS-CoV-2 ‒ ангиотензинконвертирующим ферментом-2 (ACE2). Эпитопы, с которыми связываются нанотела, располагаются в рецепторсвязывающем домене (RBD) S-белка и слабо перекрываются, поэтому смесь нанотел может сохранять потенциальную терапевтическую эффективность и в отношении новых вариантов S-белка. Смесь нанотел, обладающих компактным размером и высокой стабильностью, может стать основой для создания терапевтического препарата, доставляемого к пораженному органу в виде аэрозоля.

Синтезирована серия новых флуоресцентных узкобороздочных лигандов DB₃(n) и охарактеризованы свойства этих лигандов. Соединения DB₃(n) на основе димерных трисбензимидазолов обладают способностью связываться с АТ-участками ДНК. Синтез DB₃(n), трисбензимидазольные фрагменты которых связаны олигометиленовыми линкерами разной длины (n = 1, 5, 9), основан на конденсации мономерного трисбензимидазола MB₃ с α,ω-алкилдикарбоновыми кислотами. DB₃(n) в субмикромолярной концентрации (0.20–0.30 мкМ) оказались эффективными ингибиторами каталитической активности интегразы ВИЧ-1. Обнаружено, что DB₃(n) ингибирует каталитическую активность ДНК-топоизомеразы I в низких микромолярных концентрациях.

Транскатетерная артериальная химиоэмболизация ‒ один из интервенционных методов лечения гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). Этот метод обычно используют для пациентов с ГЦК от промежуточной до прогрессирующей стадий. Логично предположить, что идентификация генов, связанных с ГЦК, позволит повысить результативность транскатетерной артериальной химиоэмболизации. С целью исследовать роль связанных с ГЦК генов, и предоставить достоверные доказательства лечения с применением транскатетерной артериальной химиоэмболизации мы провели комплексный биоинформатический анализ. С помощью интеллектуального анализа текста (“гепатоцеллюлярная карцинома”) и анализа данных микрочипа (GSE104580) мы получили стандартный набор генов, который проанализировали по генной онтология и Киотской энциклопедии генов и геномов (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Значимые восемь генов, кластеризованные в сеть белок-белковых взаимодействий, выбрали для дальнейших исследований. При анализе выживаемости обнаружено, что низкая экспрессия ключевых генов тесно связана с показателем выживаемости пациентов, принимавших участие в исследовании. Для оценки корреляции между экспрессией ключевых генов и иммунной инфильтрацией опухоли использовали корреляционный анализ Пирсона. В результате идентифицировано 15 препаратов, нацеленных на семь из восьми исследованных генов, на основании чего их можно рассматривать как потенциальные лекарственные компоненты для транскатетерной артериальной химиоэмболизации при лечении ГЦК.

Разработана диагностическая система, основанная на рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA), для выявления шести бактериальных возбудителей пневмонии человека. Сконструированы и оптимизированы видоспецифичные праймеры для проведения мультиплексной реакции в одном общем объеме. Использованы меченые праймеры для надежной дискриминации близких по размеру продуктов амплификации. Идентификацию возбудителя проводят путем визуального анализа электрофореграммы. Аналитическая чувствительность разработанной мультиплексной RPA составила 10²‒10³ копий ДНК. Специфичность метода определяли по отсутствию перекрестной амплификации исследованных образцов ДНК возбудителей пневмонии для каждой пары праймеров, а также для ДНК Mycobacterium tuberculosis H37_rν. Для исследованных образцов этот показатель составил 100%. Время выполнения анализа – менее часа, включая электрофоретический контроль реакции. Тест-система может найти применение в профильных клинических лабораториях для экспресс-анализа образцов от пациентов с подозрением на пневмонию.