New approaches to the study of cell vital activity cultivated in different growing conditions with analysis of oxygen in the medium

Larisa T. Volova; Волова Л. Т.; Evgeni I. Pugachev; Пугачев Евгений Игоревич; Tatyana K. Riazanova; Рязанова Т. К.; Irina F. Nefedova; Нефедова И. Ф.; Violetta V. Boltovskaya; Болтовская В. В.; Natalya A. Maksimenko; Максименко Н. А.

doi:10.35693/2500-1388-2019-4-4-68-72

Новые подходы к изучению жизнедеятельности клеток в разных условиях культивирования с оценкой растворенного в питательной среде кислорода

Авторы: Волова Л.Т.¹, Пугачев Е.И.¹, Рязанова Т.К.¹, Нефедова И.Ф.¹, Болтовская В.В.¹, Максименко Н.А.¹
Учреждения:
1. ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава РФ
Выпуск: Том 4, № 4 (2019)
Страницы: 68-72
Раздел: Цитология
Статья опубликована: 15.12.2019
URL: https://innoscience.ru/2500-1388/article/view/43793
DOI: https://doi.org/10.35693/2500-1388-2019-4-4-68-72
ID: 43793

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель – разработать новые подходы к изучению морфофункционального состояния хондробластов, культивируемых при 37°C на 3D-носителе из аллоспонгиозы в разных условиях: в CO₂-инкубаторе при 5% CO₂ и в термостате в герметичной пробирке.

Материал и методы. Исследование проведено на первичных хондробластах, выделенных из хряща суставных поверхностей фаланг добавочных пальцев. Клетки помещались на 3D-носитель – деминерализованную лиофилизированную спонгиозу человека «Лиопласт»^®. Культивирование клеток проводили в полной ростовой среде при температуре 37°С в разных условиях: в закрытой системе в термостате и в открытой системе в CO₂-инкубаторе (5% CO₂). Для оценки морфофункционального состояния клеток на поверхности носителя использовали окраску пикросириусом красным, набор флюоресцентных красителей LIVE/DEAD^® и растровую электронную микроскопию. Для получения данных о концентрации кислорода в питательной среде применяли модифицированный метод титрования по Винклеру.

Результаты. С помощью комплекса морфологических методов подтверждено наличие живых клеток на поверхности аллоспонгиозы через 7 суток культивирования. Клетки имеют веретеновидную или полигональную форму и могут расти в 2 и более слоев. Титриметрический анализ показал снижение содержания растворенного в среде кислорода с клеточно-тканевым материалом через 7 суток культивирования на 72,4% в термостате и 63,5% в CO₂-инкубаторе. В пробирках без клеток с одним только носителем также происходило снижение содержания кислорода на 47,3% в термостате и 66,1% в CO₂-инкубаторе.

Выводы. 1. На основе титриметрического метода Винклера разработан способ оценки содержания растворенного кислорода в питательной среде при выращивании адгезивных клеточных культур на 3D-носителе. 2. Сравнительный анализ содержания растворенного в питательной среде кислорода при культивировании хондробластов на 3D-носителе из аллоспонгиозы в CO₂-инкубаторе и в закрытой пробирке в термостате показал общую тенденцию к снижению концентрации кислорода в течение 7 суток культивирования. 3. Установлен факт снижения концентрации кислорода в течение 7 суток в пробирках с образцами аллоспонгиозы (без клеток). 4. Эффективным и экономически выгодным способом создания тканеинженерных конструкций для хондропластики является заселение 3D-носителя из аллоспонгиозы хондробластами ювенильного суставного хряща и последующее культивирование в герметичной пробирке полностью заполненной питательной средой в течение 7 суток.

Ключевые слова

тканеинженерная конструкция, аллоспонгиоза, 3D-носитель для культур клеток, хондробласты, титриметрия, гистологическое исследование

Полный текст

ТИК – тканеинженерная конструкция; ДИ – доверительный интервал.

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы возрастает необходимость в разработке новых технологий выращивания различных клеточных культур на 2D- и 3D-носителях, а также в оценке жизнедеятельности клеток на таких матрицах-носителях. Такая тенденция обусловлена поиском оптимальных условий культивирования клеток для дальнейшего использования их в регенеративной медицине [1].

Многие ученые сходятся во мнении, что задачи по стимуляции пролиферации клеточной линии, дифференцировки в нужном направлении, а также точечной доставки клеток в организм реципиента при трансплантации ложатся именно на носители [2]. В настоящее время для лечения поврежденной хрящевой ткани разрабатываются тканеинженерные конструкции (ТИК) на основе хондробластов, мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из различных источников (жировой ткани, пуповины, костного мозга) [3, 4]. Как правило, в качестве носителей для клеток используют биодеградируемые материалы из альгинатов, хитозана, коллагенов или твердые каркасы из керамики, коралла, всевозможных соединений кальция с напылением биологически активных веществ (факторов пролиферации и дифференцировки) [5–7].

Особый интерес представляют ТИК на основе природных нанострурированных материалов, такие как разработанный в НПЦ «Самарский банк тканей» СамГМУ клеточный продукт на основе аллогенных хондробластов из ювенильного хряща суставных поверхностей фаланг добавочных пальцев (удаленных у детей с полидактилией) и 3D-бионосителя из деминерализованной лиофилизированной губчатой формации костной ткани человека.

В силу своей пористой структуры и химического состава носитель для клеток из человеческой аллоспонгиозы не только является уникальным каркасом, обеспечивающим транспорт клеток в область повреждения, но и служит своеобразным «биореактором» для хондробластов, стимулирующим их деление и дифференцировку [8].

Однако на данный момент недостаточно сведений о морфологическом состоянии хондробластов, а также особенностях их адаптации в условиях культивирования на 3D-носителе из аллоспонгиозы.

ЦЕЛЬ

Выполнить морфологическое исследование культуры хондробластов на бионосителе из аллоспонгиозы и сравнительный анализ растворенного в питательной среде кислорода (важного дыхательного субстрата для клеток) в условиях стандартного культивирования в открытой системе (37°C, 5% CO₂) и в закрытой системе (37°C, герметичная емкость).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для создания ТИК использовали следующие материалы (рисунок 1): культура хондробластов из хряща суставных поверхностей фаланг добавочных пальцев, удаленных у детей с полидактилией (патент РФ №2627817, от 11.08.2017 г.); 3D-носитель из лиофилизированной человеческой аллоспонгиозы Лиопласт^®, изготовленной в Самарском банке тканей СамГМУ (патент РФ №2366173 от 15.05.2008 г.).

Рисунок 1. Компоненты ТИК: А – хондробласты из хряща межфаланговых суставов человека. Нативный препарат. Увеличение 100; Б – деминерализованная лиофилизированная аллоспонгиоза Лиопласт®

Посев хондробластов на 3D-носитель из аллоспонгиозы Лиопласт®. Хондробласты получали из хряща межфаланговых суставов добавочных пальцев, удаленных у детей с полидактилией. Клеточную культуру на 15 пассаже высевали в количестве 5×104 на губчатый 3D-носитель объемом 27 мм3 (блок 3×3×3 мм). Полученные таким образом ТИК помещали в пробирки с полной ростовой средой (по 2 шт. в пробирку) и культивировали в разных условиях в течение 7 суток при 37°C: в пробирке с вентилируемой крышкой при 5% CO₂ и в герметично закрытой пробирке, полностью заполненной питательной средой. Контролем послужил носитель без клеток, помещенный в аналогичные условия.

Растровая электронная микроскопия. Исследование ТИК было выполнено на кафедре металловедения, порошковой металлургии и наноматериалов СамГТУ на растровом электронном микроскопе JEOL JSM-6390A Analysis Station (Япония).

Биообъекты после культивирования в течение 7 суток отмывали, фиксировали 2,5-процентным водным раствором глютарового альдегида и проводили по батарее спиртов возрастающей концентрации. Непосредственно перед микроскопированием поверхность образцов напыляли золотом или углеродом для улучшения электропроводности материала.

Флюоресцентная микроскопия. Хондробласты, прикрепленные к поверхности 3D-носителя из аллоспонгиозы после 7-дневного культивирования, окрашивали с помощью The Live/Dead^®Viability/Cytotoxicity Assay Kit, Thermo Fisher Scientific (США) по протоколу производителя. Calcein AM дает зеленую флуоресценцию живых клеток (515 нм), а ethidium homodimer-1 – красную флуоресценцию мертвых клеток (635 нм). После окраски образцы исследовали на микроскопе с флюоресцентным модулем Leica DMIL LED (Германия).

Гистологическое исследование. ТИК после культивирования в течение 7 суток фиксировали в 10-процентном формалине, обезвоживали в спиртах восходящей крепости, затем заливали в парафин и изготавливали серийные срезы толщиной 7–10 мкм. Препараты окрашивали пикросириусом красным и изучали на световом микроскопе Olympus BX41 с камерой Jenoptik ProgRes^®CF (Германия).

Определение кислорода в питательной среде (йодометрическое титрование по Винклеру). Содержание кислорода, растворенного в питательной среде, определяли титриметрическим методом (йодометрическое титрование по Винклеру). Метод основан на способности гидроксида марганца (II) окисляться до гидроксида марганца (IV) в щелочной среде, количественно связывая при этом кислород. В кислой среде гидроксид марганца (IV) снова переходит в гидроксид марганца (II), окисляя при этом эквивалентное связанному кислороду количество йода, выделившийся йод оттитровывают тиосульфатом натрия.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследование ТИК на растровом электронном микроскопе

На рисунке 2 отчетливо видны клетки веретеновидной формы, распластанные на поверхности (трабекулах) носителя. Отростки клеток анастомозируют друг с другом. Наблюдается общее продольное направление роста клеток.

Рисунок 2. Хондробласты, прикрепленные к поверхности 3D-носителя из аллоспонгиозы. 7 суток культивирования. Растровая электронная микроскопия.

Исследование гистологических препаратов ТИК

Окраска Live/Dead^® демонстрирует жизнеспособность хондробластов на 3D-носителе из спонгиозы, что подтверждается зеленым свечением клеток (рисунок 3А), и дополняет полученные фотографии гистологических препаратов, окрашенных пикросириусом красным, где был показан характер роста хондробластов на носителе через 7 суток культивирования ТИК.

На поверхности носителя наблюдаются клетки как фибробластоподобной, так и полигональной формы (рисунок 3Б). Ядра в таких клетках занимают значительную часть пространства в цитоплазме. За счет укороченных отростков клетки могут располагаться компактно и формировать два и более слоя. Причем такая картина роста характерна для ТИК из обеих исследуемых групп: выращенных и в вентилируемой пробирке в CO₂-инкубаторе (37°C и 5% CO₂), и в герметичной пробирке в обычном термостате (37°C).

Рисунок 3. ТИК через 7 суток культивирования: А – живые, светящиеся зеленым клетки на поверхности аллоспонгиозы. Окраска – набор флюурофоров Live/Dead; Б – хондробласты, растущие на поверхности 3D-носителя. Окраска – пикросириус красный. Увеличение 400.

Анализ растворенного в питательной среде кислорода

Анализ содержания растворенного в питательной среде кислорода показал, что в обеих группах сравнения («Термостат» и «CO₂-инкубатор») имеется тенденция к снижению содержания кислорода в питательной среде (таблица 1).

Период отбора проб / параметр		Термостат		СО₂-инкубатор
Период отбора проб / параметр		Носитель без клеток	ТИК	Носитель без клеток	ТИК
День 0	Среднее (95% ДИ)	5,03 (4,37-5,69)	5,29 (4,69-5,89)	4,81 (4,21-5,41)	5,29 (4,69-5,89)
День 1	Среднее (95% ДИ)	3,39 (3,09-3,69)	3,48 (3,04-3,92)	4,73 (4,31-5,15)	5,16 (4,63-5,69)
День 7	Среднее (95% ДИ)	2,65 (2,31-2,99)	1,46 (1,00-1,92)*	1,63 (1,17-2,09)	1,93 (1,57-2,29)
Разница средних значений содержания кислорода (95% ДИ)	День 1 по сравнению с Днем 0	-1,65 ((-2,30)-(-1,00))	-1,81 ((-2,18)-(-1,44))	-0,08±0,34 ((-0,42)-0,26)	-0,13 ((-0,46)-0,20)
	День 7 по сравнению с Днем 1	-0,74 ((-1,00)-(-0,48))	-2,03 ((-2,47)-(-1,59))*	-3,40 ((-3,85)-(-2,95))	-3,23 ((-3,59)-(-2,87))
	День 7 по сравнению с Днем 0	-2,39 ((-2,74)-(-2,04))	-3,83 ((-4,25)-(-3,41))*	-3,48 ((-3,87)-(-3,09))	-3,36 ((-3,62)-(-3,10))

Примечание: ДИ – доверительный интервал; * – р<0,05 по сравнению с контролем; – р<0,05 по сравнению со значением в День 0; – р<0,05 по сравнению со значением в День 1.

Таблица 1. Содержания кислорода в питательной среде при культивировании хондробластов на носителе в разных условиях (мкг/мл)

Table 1. Oxygen concentration in the culture medium when cultivating chondroblasts on a carrier under different conditions (mcg/ml)

Изменения в контрольных и опытных группах за 7 дней эксперимента. Содержание кислорода в пробирках с ТИК через 7 дней культивирования снизилось на 72,4% – в термостате и 63,5% – в CO₂-инкубаторе. Кроме того, в пробирках без клеток, с одним только носителем, также происходило снижение содержания растворенного кислорода, которое составило 47,3% – в термостате и 66,1% – в CO₂-инкубаторе.

Сравнение контрольных и опытных образцов внутри групп сравнения. Содержание кислорода в пробирках с носителем и в пробирках с ТИК в группе из термостата было примерно на одном уровне в начале эксперимента и составило 5,03 мкг/мл – с носителем, 5,29 мкг/мл – с ТИК. Уже через 1 день культивирования эти показатели резко снизились и составили 3,39 мкг/мл – с носителем и 3,48 мкг/мл – с ТИК. К 7-м суткам культивирования также было зафиксировано снижение концентрации кислорода. При этом наблюдалась более выраженная достоверная разница между контрольными и опытными образцами: 2,65 мкг/мл – с носителем, 1,46 мкг/мл – с ТИК.

Содержание кислорода в контрольных и опытных пробирках в группе из CO₂-инкубатора отличалось уже в начале эксперимента и составило 4,81 мкг/мл – с носителем и 5,29 мкг/мл – с ТИК. Через 1 день культивирования эти показатели практически не изменились (4,73 мкг/мл – с носителем, 5,16 мкг/мл – с ТИК), а спустя 7 дней они упали до 1,63 мкг/мл и 1,93 мкг/мл в соответствующих группах.

Сравнение аналогичных образцов из разных групп сравнения. В начале эксперимента (день 0) показатели кислорода в среде с ТИК в группах сравнения («Термостат» и «CO₂-инкубатор») были идентичны и составили 5,29 мкг/мл. Через сутки показатели в этих группах отличались: 3,48 мкг/мл – в термостате, 5,16 мкг/мл – в CO₂-инкубаторе. Через 7 суток концентрация кислорода в пробирках с ТИК составила 1,46 мкг/мл – в термостате и 1,93 мкг/мл – в CO₂-инкубаторе.

В пробирках с носителем без клеток в начале эксперимента концентрация кислорода составила 5,03 мкг/мл – в термостате и 4,81 мкг/мл – в CO₂-инкубаторе. Через сутки в пробирках из CO₂-инкубатора изменений практически не было (4,73 мкг/мл), а в термостате концентрация кислорода в пробах снизилась и составила 3,39 мкг/мл. Спустя 7 суток концентрация кислорода в пробирках с пустым носителем составила 2,65 мкг/мл – в термостате и 1,63 мкг/мл – в CO₂-инкубаторе.