Клинико-иммунологическая характеристика COVID-19 у пациентов в динамике заболевания

Полный текст

Список сокращений

ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы; ФП – фагоцитарный показатель;

КТ – компьютерная томография; ССЗ – сердечно-сосудистое заболевание;

СД – сахарный диабет.

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на то что в мае 2023 года ВОЗ объявила об окончании пандемии COVID-19, данные о сохранении у реконвалесцентов симптомов, значительно снижающих качество жизни, продолжают появляться. Основные жалобы предъявляются на усталость, одышку, мышечную слабость, нарушение концентрации внимания, нарушение обоняния, отсутствие сна [1]. Высокая распространенность дыхательной недостаточности в исходе новой коронавирусной инфекции, необходимость искусственной вентиляции легких у пациентов с тяжелым течением заболевания способствуют развитию отдаленных легочных осложнений, в первую очередь легочного фиброза [2]. В основе патогенеза COVID-19 лежат патоиммунологические механизмы с повреждающим действием на органы и ткани.

Разнообразие клинических проявлений течения инфекции в катамнезе обусловливает интерес к изучению клинико-иммунологических изменений в динамике у реконвалесцентов COVID-19 разных возрастов. Патогенез полиорганных поражений при COVID-19 многообразен и связан, во-первых, с прямым цитопатическим действием вируса на тропные клетки, во-вторых, c повреждающим действием цитокинов, в-третьих, c нарушением системы гемостаза из-за повреждения эндотелия с развитием тромбозов.

Вопрос развития отдаленных изменений перенесенной инфекции, а также провоспалительных механизмов пролонгации изменений легких интересует ученых давно. Наиболее хорошо аспекты формирования фиброза легких в исходе вирусных инфекций изучены на примерах гриппа, MERS-CoV, SARS-CoV [3, 4, 2, 5–7]. Так, при гриппе, вызванном вирусом H1N1, развитие фиброза имеет мультифакторную природу: агрессивная фибробластическая активность, возникающая в ответ на массивное поражение легочной ткани и гипоксию, высокий уровень TNF-α, коррелирующий с длительностью гипоксии, независимая от других факторов роль TGF-β в стимулировании пролиферации фибробластов с последующим ростом соединительной ткани [3, 8, 9].

Отечественные ученые на основании данных ретроспективного анализа зарубежных коллег определили патогенетические механизмы индуцированного SARS-CoV-2 легочного фиброза [1–3]. Важная роль отведена фактору некроза опухоли-α, трансформирующему фактору β, интерлейкину-6, что подтверждается повышением данных маркеров в сыворотке у пациентов с COVID-19. В литературе описаны случаи обнаружения биомаркеров фиброгенеза в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) через 24 часа после развития ОРДС [1, 2]. Данные оценки биомаркеров в сыворотке крови в сравнении с рентгенологическими данными в динамике у реконвалесцентов не приводятся.

Актуальность и клиническая значимость иммунологических аспектов развития прижизненных осложнений заболевания в виде фиброза изучается многие годы [2, 3]. Понимание механизмов, участвующих в развитии долгосрочных последствий инфекции SARS-CoV-2, обусловливает необходимость мониторинга пациентов после острой стадии инфекции SARS-CoV-2.

ЦЕЛЬ

Изучить клинико-иммунологические показатели реконвалесцентов COVID-19 через один и три месяца после перенесенного заболевания с определением предикторов развития изменений в легких.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Работа проводилась на базе научно-исследовательского центра ОрГМУ. Критерии включения в исследование: наличие положительного результата ПЦР из носоглотки на наличие SARS-CoV-2, двусторонняя вирусная пневмония по результатам компьютерной томографии органов грудной клетки. Все пациенты при госпитализации подписали информированное добровольное согласие на обработку персональных данных и медицинское вмешательство.

Были обследованы 35 реконвалесцентов в возрасте от 22 до 75 лет в динамике заболевания (1, 3 месяца после выздоровления) COVID-19. В ходе обследования пациенты были разделены на две группы в соответствии с выявленными клинико-иммунологическими нарушениями. Первая группа – лица молодого и среднего возраста (n=20). Вторая группа – лица пожилого и старческого возраста (n=15). В качестве контроля были использованы нормативные значения иммунологических показателей, разработанные в проблемной лаборатории по изучению механизмов естественного иммунитета ОрГМУ.

У всех обследованных определены маркеры клеточного иммунитета (CD-3, CD-4, CD-8, CD-19) методом иммуно-флюоресценции с использованием моноклональных антител фирмы «Сорбент» (Москва); фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс по отношению к St. aureus, метаболическая активность сегментоядерных нейтрофилов в спонтанной и индуцированной реакции с нитросинимтетразолием (HCT-тест); уровень иммуноглобулинов классов А, М, G в реакции иммунодиффузии, а также содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в реакции преципитации с полиэтиленгликолем, цитокины IL-6, IL-8, TGF-β, TNF-α методом ИФА на тест-системах фирмы «Вектор Бест». Для выявления возможной связи между качественными признаками определили коэффициент Пирсона, между количественными и качественными признаками использовали методы группового и однофакторного дисперсионного анализа с определением F-критерия, критерий Краскела – Уоллиса. Были использованы методы многомерной статистики, а именно дескриптивная (описательная) статистика. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием компьютерной программы Statistica 10.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полученные результаты представлены в таблицах 1–3. Средний возраст пациентов первой группы составил 53,7±13,5 года с преобладанием лиц мужского пола – 60% (15 пациентов). Во второй группе средний возраст – 76,2±13,8 года также с преобладанием лиц мужского пола – 63,2% (12 пациентов). Преобладание лиц мужского пола в исследуемой группе связано с гендерными особенностями эпидемиологии острых вирусных инфекций [10–12].

 

Таблица 1. Общая характеристика исследуемых групп пациентов

Table 1. General characteristics of the studied groups of patients

Показатель		Общая выборка	Молодой и средний возраст (n=20)	Пожилой и старческий возраст (n=15)
Возраст		52,4±17,6	53,7±13,5	76,2±13,8
Пол	мужской	23 (65,7%)	13 (65%)	10 (66,7%)
	женский	12 (34,3%)	7 (35%)	5 (33%)
ССЗ		5 (14%)	4 (20%)	1 (6,7%)
ДС		3 (8,5%)	1 (2%)	2 (13,3%)
Сахарный диабет		4 (11,4%)	2 (10%)	2 (13,3%)
Ожирение		4 (11,4%)	2 (10%)	2 (13,3%)
Рассеянный склероз		2 (5,7%)	2 (10%)	0
Смешанная нозология		10 (28,5%)	2 (10%)	8 (53%)
Тяжелая степень COVID-19		12 (34,3%)	5 (25%)	7 (46,7%)
Длительность заболевания до госпитализации, M±SD		6,3±1,7	7,8±2,2	8,5±2,15
Длительность госпитализации, M±SD		13,56±3,44	12,47±4,03	23,71±11,2

 

Таблица 2. Показатели иммунного статуса у реконвалесцентов COVID-19 в катамнезе

Table 2. Indicators of immune status in COVID-19 convalescents in the catamnesis

Показатели иммунного статуса у реконвалесцентов		Через 1 месяц Ме [Q25; Q75]		Через 3 месяца Ме [Q25; Q75]
		1 группа (n=25)	2 группа (n=19)	1 группа (n=25)	2 группа (n=19)
Лейкоциты, 109/л		4,1	7,9	7,1	5,6
Лимфоциты	%	25,6 [24, 25; 27, 25]	10,4 [9, 1; 14, 3]	35,4 [27; 41]	24,1 [19, 8; 29, 7]
	109/л	1,09 [1, 25; 1, 37]	0,81 [0, 61; 1, 45]	2,4 [1, 96; 3, 034]	1,97 [1, 86; 2, 091]
CD-3	%	52 [46, 25; 57, 25]	44 [39; 54]	56 [50; 60]	47 [46;51]
	109/л	0,46 [0, 62;0, 72]	0,511 [0, 166; 0, 751]	1,344 [0, 98; 1, 608]	0,943 [0, 82; 0, 95]
CD-4	%	36 [35; 37, 5]	30 [26; 41]	48 [42; 53]	33,6 [30;41]
	109/л	0,37 [0, 19; 0, 49]	0,23 [0, 16; 0, 41]	1,152 [0, 769; 1, 305]	0,219 [0, 12; 0, 68]
CD-8	%	25 [18; 30]	32 [25; 34]	30 [23;31]	21,6 [20, 2; 26, 3]
	109/л	0,297 [0, 18;0, 67]	0,29 [0, 19; 0, 47]	0,72 [0, 52; 0, 758]	0,386 [0, 23;0, 51]
CD-19	%	14 [10; 17]	15 [12; 21]	16 [12; 23]	21,4 [20;24]
	109/л	0,129 [0, 13; 0, 19]	0,15 [0, 11; 0, 21]	0,379 [0, 359; 0, 48]	0,414 [0, 37; 0, 49]
ФП, %		49,5 [33, 5; 66, 75]	33 [28, 7; 42, 9]	39 [33; 50]	38,2 [35; 41]
ФИ, усл. ед.		5,65 [4, 525; 6, 4]	3,8 [3, 5; 3, 9]	3,9 [3, 7; 4, 2]	4,34 [3, 9; 4, 4]
HCT спонтанный, %		3,62 [3; 4, 35]	1,2 [0, 7; 2, 3]	1,0 [0, 7; 1, 3]	2,72 [1; 4, 3]
HCT стимулированный, %		27,8 [15; 46, 28]	44,2 [37, 8; 45, 4]	35,7 [34, 7; 43, 7]	35,14 [25, 7; 47, 3]
ЦИК, ЕД ОП		144 [154;169, 5]	178 [67; 393]	113 [96; 227]	233,2 [175;193]
IgA, г/л		2,4 [2, 13; 3, 125]	2,53 [2, 15; 3, 03]	2,84 [2, 23; 4, 46]	3,51 [2, 57;4, 22]
IgM, г/л		0,8 [0, 6; 1, 05]	1,31 [1, 13; 1, 31]	1,31 [1, 31; 1, 76]	0,84 [0, 6;1, 2]
IgG, г/л		10,2 [6, 8; 13, 34]	10,56 [8, 94; 10, 68]	11,52 [6, 91; 13, 81]	10 [6, 79; 13, 81]
IgM, спец. к вирусу SARS-CoV-2		0,95 [1; 1, 3]	4,71 [3, 15; 10, 73]	3,86 [1, 77; 4, 42]	1,64 [1, 2; 1, 97]
IgG, спец. к вирусу SARS-CoV-2		18,9 [15, 6; 20]	16,9 [14, 92; 18, 67]	15,90 [11, 92; 20, 17]	16,65 [15; 17]

Примечания. Жирным шрифтом выделены показатели, достоверно (p<0,05) отличающиеся от нормативных значений.

 

Таблица 3. Оценка цитокинов в крови у реконвалесцентов COVID-19 в динамике

Table 3. Assessment of cytokines in the blood of COVID-19 convalescents in dynamics

	Через 1 месяц		Через 3 месяца		Нормы
	1 группа	2 группа	1 группа	2 группа
IL-6	8,6	53,16	3,3	33,72	Не > 10 пг/мл
IL-8	7,3	8,34	13,4	11,49	Не > 10 пг/мл
TNF-α	5,1	4,36	3,7	6,1	Не > 6 пг/мл
TGF-β	6,43	18,72	22,3	11,88	Не >38 нг/мл

 

При анализе коморбидного фона выявили, что у пациентов молодого и среднего возраста по частоте встречаемости преобладали сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) (рисунок 1). У лиц пожилого и старческого возраста преобладали заболевания смешанной нозологии (сахарный диабет, ожирение, ССЗ, заболевания дыхательной системы (ДС)). Наиболее статистически значимыми (p<0,05) были ССЗ в обеих возрастных группах, а также сахарный диабет у пациентов пожилого и старческого возраста.

 

Рисунок 1. Характеристика выборки с учетом коморбидного фона.

Figure 1. Characteristics of the sample, taking into account the comorbid background.

 

Среди пациентов с тяжелыми формами заболевания лица пожилого и старческого возраста составили 58% (7 пациентов) от числа исследуемых (рисунок 2). Коморбидный фон, а также длительность заболевания до госпитализации имели статистическую значимость на развитие тяжести заболевания, что совпадает с литературными данными [10, 11, 13].

 

Рисунок 2. Характеристика выборки с учетом степеней тяжести.

Figure 2. Characteristics of the sample, taking into account the degrees of severity.

 

Жирным шрифтом выделены показатели, достоверно отличающиеся от нормативных значений (p<0,05). К таким относятся показатели Т-клеточного иммунитета CD-3, CD-4, цитотоксические лимфоциты CD-8, фагоцитарный показатель, фагоцитарный индекс, IgА, содержание ЦИК, тест восстановления нитросинего тетразолия.

В обеих группах установили абсолютную и относительную лимфопению (CD-3, CD-4) через месяц после выздоровления. У пациентов второй группы сохранялись изменения в течение последующих трех месяцев со стороны CD-3 и CD-4.

Незначительные различия в обеих группах выявлены при оценке уровня CD-8 через месяц после выздоровления. Через три месяца отмечалась тенденция к снижению уровня CD-8 в сравнении с контрольными значениями у пациентов пожилого возраста.

У пациентов обеих групп уровень IgА через месяц имел пограничные значения при нормальном распределении IgM и IgG. У пациентов пожилого возраста через три месяца выявили повышение уровня IgА при нормальных значениях IgМ и G. Содержание специфических IgM и IgG к SARS-CoV-2 в обеих группах в достаточном объеме сохранялись в течение всего периода наблюдения.

Содержание ЦИК было увеличено в обеих группах через месяц после выздоровления и в динамике.

Незначительные различия были выявлены в обеих группах при оценке ФП. Отмечалось его снижение при неизменном фагоцитарном индексе, снижение спонтанного HCT-теста через месяц после выписки. Через три месяца изменения сохранялись у второй группы пациентов.

При оценке цитокинов были выявлены разнонаправленные изменения (рисунки 3, 4). У первой группы изменения появились лишь через три месяца в виде повышения IL-8. У пациентов второй группы повышение IL-6 наблюдалось через месяц после перенесенной инфекции, несмотря на применение таргетной терапии. Через три месяца появился прирост IL-8, TGF-β (рисунок 5).

 

Рисунок 3. Изменение цитокинов через 1 месяц у реконвалесцентов.

Figure 3. Cytokine changes after 1 month in convalescents.

 

Рисунок 4. Изменение цитокинов через 3 месяца у реконвалесцентов.

Figure 4. Cytokine changes after 3 months in convalescents.

 

Рисунок 5. Изменение цитокина TGF-β через 1, 3 месяца у реконвалесцентов, нг/мл.

Figure 5. Change in cytokine TGF-β after 1, 3 months in convalescents, ng/ml.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем исследовании было установлено, что у всех обследуемых сохраняются клинико-иммунологические изменения в течение всего периода наблюдения. Это свидетельствовало о продолжающемся заболевании. Выявленные существенные отличия степени изменений клинико-иммунологических показателей у лиц с учетом возраста и наличия хронической соматической патологии выражаются в первую очередь в нарушении параметров Т-системы иммунитета. Выявленные обстоятельства отличаются новизной и нуждаются в обсуждении [14, 15]. Актуальной проблемой является оценка рисков развития тяжелого течения, а также влияние различных факторов и развитие неблагоприятных исходов [16, 2, 17]. Сохранение у реконвалесцентов COVID-19 симптомов свыше 21 дня подтверждает важность изучения изменений параметров иммунитета после перенесенного заболевания [12, 16, 18, 19].

В соответствии с данными литературы ведущая роль в формировании иммунитета отведена CD4+ T-клеткам за счет нейтрализации антител и эмиграции лимфоцитов в легочную ткань [20, 4]. Также функциональное снижение уровня цитотоксических лимфоцитов CD8+ коррелирует с прогрессированием заболевания, и наоборот [5, 7]. Нарушение в нескольких компонентах иммунной системы может свидетельствовать о персистирующем характере вируса, а следовательно, о сохранении специфического воспалительного ответа и обширного повреждения ткани.

Так и в нашем исследовании нарушение количества CD-3, CD-4 клеток у пациентов связано с развитием тяжелых форм, несмотря на исходное среднетяжелое течение. На длительность восстановления нормальных значений иммунитета оказывает влияние возраст. В дополнение появление количественных изменений цитотоксических лимфоцитов CD-8 у пациентов второй группы в течение трех месяцев после перенесенного заболевания создает условия для обострения хронических инфекций, риска развития других острых инфекций, но еще недостаточно для развития аутоиммунных реакций. Необходимо дальнейшее изучение иммунных параметров в катамнезе для понимания механизмов отстроченных изменений в организме реконвалесцентов [12, 16, 19].

Как правило, у пациентов, перенесших новую коронавирусную инфекцию, должен сформироваться гуморальный и клеточный иммунитет, однако ответ антител и спе-цифических CD8+ Т-лимфоцитов развивается независимо друг от друга и обусловлен генетическими факторами [21, 19]. У обследованных групп в течение трех месяцев после перенесенного заболевания сохраняется способность к специфическому гуморальному ответу с учетом нормального содержания цитотоксических лимфоцитов [14, 5].

Увеличение содержания ЦИК в обеих группах в динамике заболевания может быть связано с обострением хронических заболеваний, а также способствует высокому риску развития аутоаллергических реакций [11, 20, 4].

Актуальным прижизненным исходом COVID-19, влияющим на качество жизни пациента, является развитие пневмофиброза [13, 17, 22]. В литературе отслеживается как минимум два механизма развития фиброза легких при новой коронавирусной инфекции. Во-первых, способность SARS-CoV-2 индуцировать снижение клиренса АПФ-2 в легких, что приводит к нарушению регуляции TGF-β и CTGF [3, 5, 15]. Во-вторых, прямое цитопатическое действие TNF-α на эндотелий капилляров альвеолярной стенки, при этом провоспалительное действие обеспечивается за счет IL-6, IL-8, IL-18 [3, 10]. Повреждение базальных мембран, которое наблюдается при новой коронавирусной инфекции, способствует прогрессирующему росту фибробластической ткани. Прогностическое значение данных факторов остается малоизученным и актуальным для понимания рисков развития отдаленных последствий перенесенного заболевания.

Выявленные изменения цитокинов (IL-6, IL-8, TNF-α, TGF-β) у реконвалесцентов COVID-19 рассматривались в аспекте развития постковидных изменений в легких с помощью метода компьютерной томографии легких [10, 5]. Повышение IL-8 и TGF-β в сопоставлении с рентгенологической картиной пневмофиброза у реконвалесцента подтверждает корреляцию показателей. Отсутствие пневмофиброза на КТ может свидетельствовать об имеющейся высокой предрасположенности к развитию пневмофиброза с характерными изменениями крови при наличии любого триггера (вирус гриппа, SARS-CoV-2 и др. ОРЗ) [3, 13, 17]. В схожем исследовании характеристика иммунитета у пациентов с коинфекцией гриппа и COVID-19 в остром периоде заболевания при оценке цитокинов обнаружено нормальное значение показателей IL-6, IL-8, TGF-β, TNF-α, что указывает на низкий риск развития фиброза легких [12].

ВЫВОДЫ

1. Сохранение клинико-иммунологических изменений в организме реконвалесцентов свидетельствует о персистенции вируса SARS-CoV-2, а повышение уровня ЦИК – о пролонгации повреждающего действия вируса на организм выздоровевшего.
2. Выраженные нарушения затронули изменение количества CD-3, CD-4, а именно их снижение. Статистически значимые изменения выявлены в группе пожилых пациентов за счет сохранения абсолютной и относительной лимфопении в течение всего срока наблюдения.
3. В группе риска развития пневмофиброза в исходе новой коронавирусной инфекции наиболее оптимальным является сочетание повышения уровней IL-8 и TGF-β. Отсутствие пневмофиброза на КТ при наличии иммунологической картины крови может свидетельствовать об имеющейся высокой предрасположенности к развитию пневмофиброза у данной группы пациентов.

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ	ADDITIONAL INFORMATION
Источник финансирования. Работа выполнена по инициативе авторов без привлечения финансирования.	Study funding. The study was the authors' initiative without external funding.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.	Conflict of interest. The authors declare that there are no obvious or potential conflicts of interest associated with the content of this article.
Участие авторов. Я.А. Сафронова – концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста, редактирование. М.А. Чаркина – сбор и обработка материала, написание текста. А.С. Паньков – редактирование, утверждение окончательного варианта статьи. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.	Contribution of individual authors. Ya.A. Safronova – research concept and design, material collection and processing, statistical data processing, text writing, editing. M.A. Charkina – material collection and processing, text writing. A.S. Pankov – editing, approval of the final version of the article. All authors gave their final approval of the manuscript for submission, and agreed to be accountable for all aspects of the work, implying proper study and resolution of issues related to the accuracy or integrity of any part of the work.

Об авторах

Я. А. Сафронова

Оренбургский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: charkina.ya@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3949-6851

аспирант кафедры эпидемиологии и инфекционных болезней

Россия, Оренбург

М. А. Чаркина

Оренбургский государственный медицинский университет

Email: charkina.marya@gmail.com
ORCID iD: 0009-0002-2889-5582

студентка лечебного факультета

Россия, Оренбург

А. С. Паньков

Оренбургский государственный медицинский университет

Email: aspankov@km.ru
ORCID iD: 0000-0003-4994-6633

д-р мед. наук, доцент, заведующий кафедрой

Россия, Оренбург

Список литературы

Дополнительные файлы