Prospects for assessing the biological and immunological age of a person by blood factors

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Изучение факторов крови – простой и доступный способ оценки здоровья человека и дополнения традиционных показателей его биологического возраста новыми объективными критериями [1–4]. С возрастом замедляются процессы роста и развития, регенерации и восстановления тканей; они постепенно заменяются усиленным катаболизмом, активностью воспалительных клеток и резистентностью к инсулину [3]. Увеличивается количество стареющих клеток, поддерживающих воспалительную петлю; клеточный клиренс из-за замедления митофагии и аутофагии снижается, что приводит к повреждению и дисфункции митохондрий и клеток [5, 6].

Мониторинг факторов циркулирующей крови, а также естественных жидкостей человека дает важную информацию о процессах старения и позволяет определять стратегию медицинского вмешательства для предотвращения или замедления развития возрастных заболеваний [7]. Тема вмешательства и предотвращения возрастных изменений является чрезвычайно значимой для человечества, что отражается во множестве публикаций, в популярных изданиях и многочисленных попытках коммерциализации новых «средств Макропулоса» [8]. Человечество еще находится на пути раскрытия тайны долголетия, и поэтому многочисленные исследования и разработки методов мониторинга старения, разработка средств замедления старения и предупреждения заболеваний, связанных с возрастом, привлекает колоссальное финансирование соответствующих отраслей науки [4].

С развитием мультиплексных методов экспресс-анализа метаболитов и белков в крови открывается возможность комплексной оценки состояния организма человека не только в лабораторных условиях, но и посредством индивидуальных устройств. Такие устройства первоначально предлагались пациентам с потенциально опасными для жизни заболеваниями, где необходим ежедневный мониторинг. Мобильные устройства индивидуального пользования были разработаны для таких заболеваний, как сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания, серьезные гормональные расстройства и тяжелые вирусные инфекции [9]. Однако с развитием мобильных устройств и современных методов анализа представляется возможным создание относительно дешевых приборов индивидуального пользования для мониторинга здоровья в домашних условиях [10]. Эти устройства будут способны оценивать состояние иммунной системы, скорость старения организма и даже биологический возраст. Это поможет человеку получать объективные показатели собственных усилий по поддержанию здорового образа жизни, следить за рационом питания, понимая, как это отражается на его здоровье и биологическом возрасте и как его усилия влияют на перспективу активного долголетия. Постоянное наблюдение за концентрацией и составом белков и метаболитов (КСБМ) в выделениях и физиологических жидкостях человека, таких как слюна, моча, потовые выделения, а также в плазме крови позволят создать комплексную картину состояния здоровья, основанную на объективных биохимических показателях. Информация должна будет обрабатываться в едином центре с помощью мультипараметрических статистических методов, включая нейросети. Это позволит создавать ежедневный профиль здоровья человека, а в сочетании с информацией о его физической активности и рационе питания выдавать предупреждения о негативных тенденциях в состоянии здоровья. Такая информация будет полезна не только для пациентов с установленным диагнозом, но и для диагностики и предупреждения преждевременного старения, а также негативных сценариев, приводящих к развитию старческих заболеваний. Кроме того, такие приборы незаменимы для людей, находящихся в экстремальных ситуациях, а также для женщин в период беременности и лактации. Они также смогут упростить для врачей задачу просвещения пациентов и их мотивации следовать здоровому образу жизни. Это будет способствовать увеличению количества трудоспособного населения в предпенсионном возрасте, обладающего значительным опытом и способного к интенсивному труду.

Дополнением к мобильным устройствам индивидуального пользования могла бы стать стратегия «домашний отбор образца – анализ в высокотехнологичной лаборатории». Отбирая образцы дома, пациент может отправить их по почте в единый высокотехнологичный центр и получить консультацию через мобильное приложение [10]. В едином центре будет производиться мультиплексная оценка состава образца и комплексная интерпретация результатов с выдачей рекомендаций, а также постановкой диагноза для дальнейшего назначения реабилитационных мероприятий или лечения. Устройства для индивидуального отбора образцов и их первичной обработки сократят финансовые и временные затраты на анализ образцов в стационарных высокотехнологичных лабораториях. Благодаря высокотехнологичным лабораториям, в медицинскую диагностику могли бы быть привнесены современные методы анализа плазмы крови, слюны и мочи, включая такие методы, как проточная цитометрия флуоресцентных частиц (cytometric bead arrays) [11]; MALDI-TOF масс-спектрометрия. CyTOF (cytometry by time of flight – цитометрия по времени полета) [12, 13]; масс-спектрометрический анализ; методы транскрипционного и геномного анализа единичных человеческих клеток, маркеров мутировавшей ДНК, а также общий анализ ДНК, РНК инфекционных агентов в физиологических жидкостях с использованием NGS (Next Generation Sequencing, методы секвенирования нового поколения).

Для интегральной оценки здоровья уже разработаны методики оценки биологического возраста, основанные на физиологических показателях, которые объективно отражают состояние здоровья человека, скорость его старения. Но такие методики не затрагивают причины возникновения патологических состояний, что не дает возможности определить стратегию предупреждения и лечения возможных заболеваний. К сожалению, несмотря на интенсивные исследования генетических и эпигенетических маркеров, а также метаболитов и белковых факторов в организме, до сих пор не существует четких представлений о причинно-следственных связях процесса старения. В последнее время корреляционная связь некоторых эпигенетических маркеров с биологическим возрастом обсуждается во многих обзорных работах [14–17].

Корреляция между генетической и эпигенетической регуляцией процессов старения очень сложна, а компенсаторные механизмы в организме многочисленны. С учетом этого в новейших экспериментальных работах для уточнения патологических изменений в процессе старения появилась тенденция наряду с эпигенетическими маркерами включать в модели биологического возраста факторы крови и/или экспрессионные профили генов, отражающие непосредственные изменения в функционировании организма [4, 16, 18]. Именно поэтому нам представляется особенно важным проведение анализа КСБМ, связанных с возрастом. Важно, что КСБМ могут не только прямо отражать отклонения от здорового старения, но и одновременно подсказывать стратегии корректирующих медицинских вмешательств. Разработка подходов к мониторингу данных показателей позволит разработать методики замедления старения и отсрочить развитие старческих заболеваний. Часто опасные заболевания у пожилых людей развиваются бессимптомно, и анализ специфичных факторов крови как существенное дополнение к анализу биологического возраста является наиболее рентабельным и точечным методом ранней диагностики.

Эпидемия COVID-19 сосредоточила усилия мирового сообщества на решении проблемы уязвимости пожилых людей к инфекционным заболеваниям [19]. Как оказалось, параметры биологического возраста, основанные на физиологических показателях, могут предсказывать тяжесть протекания и последствия COVID-19 [20–22]. В то же время методы анализа биологического возраста с помощью эпигенетических модификаций ДНК клеток крови не всегда способны предсказать уязвимость стареющего организма к инфекционным осложнениям [23]. И напротив, непосредственный анализ динамических параметров иммунной реакции, таких как способность лимфоцитов образовывать новые клеточные популяции, специфичные к новым антигенам, способность вырабатывать большое количество специфичных к инфекции антител, способность к быстрому выбросу провоспалительных факторов в ответ на распознавание инфекционных поверхностей, профиль воспалительных цитокинов и метаболитов, фагоцитарная активность миелоидных клеток, а также результативное успокоение иммунной реакции после удаления инфекции, значительно снижающихся с возрастом, позволяет вычислить нарастающие уязвимости иммунной системы [24].

Значительное увеличение с возрастом хронической воспалительной реакции, а также общее снижение эффективности иммунной системы связаны с накоплением в организме стареющих (сенесцентных) клеток. Так, повышенную воспалительную реакцию («цитокиновый шторм») связывают с присутствием в тканях пожилого человека сенесцентных клеток, проявляющих чрезмерную воспалительную реакцию [25]. Таким образом, тестирование параметров иммунологических возрастных изменений исключительно важно для сохранения здоровья в пожилом возрасте. Накопление сенесцентных клеткок иммунной системы провоцирует иммунодефицитные состояния [26]. Так, у пожилых людей предпенсионного и пенсионного возраста, особенно с сопутствующими заболеваниями, такими как диабет, с большей вероятностью возникает дисфункция иммунного ответа, что приводит к неспособности успешно искоренить инфекционные агенты [22, 27].

ЦЕЛЬ

Выделить критические факторы, влияющие либо отражающие старение организма, а также определить перспективные методики мультиплексного анализа КСБМ, которые могут быть использованы в портативных мобильных устройствах или в высокотехнологичных центрах анализа образцов для предупреждения заболеваний, связанных с возрастом.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ВОЗРАСТ

Индивидуальный биологический возраст человека может кардинально отличаться от календарного [1]. Разработаны многочисленные подходы к анализу биологического возраста. Обычно биологический возраст оценивается по состоянию органов и тканей организма, а также его физиологических реакций. При оценке используются морфологические, физиологические и функциональные характеристики организма и сравниваются со средним биологическим возрастом других людей того же календарного возраста [1, 28–30]. Часто используются общие физиологические параметры – состояние сосудистой системы, вестибулярного аппарата (баланс тела), скорость реакции, уровень сахара в крови, показатели метаболизма [1, 3, 31, 32], количество шагов, которое человек проходит в день [33]. Также современные исследователи используют «индекс хрупкости» [22, 34] и «индекс нарастающей нестабильности генетической регуляции» [35].

Значительным продвижением в анализе биологического возраста стало открытие эпигенетических часов [36], методов анализа модификаций районов ДНК. Так, были разработаны предикторы, основанные на анализе метилирования 353 CpG в тканях [36] или на основе 71 CpG в лейкоцитах [37]. Это дает возможность спрогнозировать продолжительность жизни с поправкой на хронологический возраст и другие факторы риска [38, 39]. В ходе дальнейших исследований количество маркеров метилирования, предсказывающих все случаи смертности, было сокращено до 10. Был разработан предиктор продолжительности жизни [40]. Для повышения точности прогноза в модель ввели одновременно маркеры метилирования и изменения экспрессии генов, связанных с воспалением, повреждением ДНК и активностью [16].

Недавно была разработана интегральная модель, где наряду с анализом метилирования ДНК был включен ряд циркулирующих факторов, отвечающих за клеточный стресс, воспаление и сигнализирующих о количестве сенесцентных клеток. Эта модель позволила со статистически достоверной точностью прогнозировать продолжительность жизни, количество старческих заболеваний, предрасположенность к диабету 2 типа. Также модель показывала тесную связь продолжительности жизни и заболеваний человека с образом его жизни, включая здоровое питание и уровень образования [18].

Скорость старения, определяющая биологический возраст, также зависит от различных внешних факторов, включая режим питания, вредные привычки, загрязнение окружающей среды [1, 41]. Индивидуальное старение может ускоряться из-за психолого-социальных факторов, таких как стресс, депрессия, нарушение сна, режима работы и отдыха или перенесенных инфекционных заболеваний [30, 42–45].

Старение является основным потенциальным фактором риска для широкого спектра состояний, таких как иммунодефицит, сердечно-сосудистые заболевания, диабет, рак и различные неврологические расстройства [46–48]. Для многих из этих заболеваний не существует эффективных методов лечения, а старение ощутимо снижает эффективность разработанных методик, несмотря на прилагаемые усилия специалистов и значительные инвестиции в клинические и лабораторные исследования [49].

Оценка индивидуального биологического возраста и идентификация маркеров старения необходимы для прогнозирования продолжительности жизни, оценки риска развития возрастных заболеваний. Кроме того, измерение биологического возраста необходимо для оценки лечебных мероприятий по замедлению возрастных изменений. Так, было показано, что ограничение калорийности пищи, контроль артериального давления, умеренная физическая активность, антивоспалительные препараты, лекарства, контролирующие чувствительность к инсулину, гигиена, прививки против инфекционных заболеваний способны снизить риск преждевременной нетрудоспособности и даже замедлить темп старения [2, 50, 51]. При этом некоторые лекарства и лечебные процедуры могут оказывать и негативное влияние, усугубляя процесс старения, увеличивая индивидуальный биологический возраст или вызывая проблемы со здоровьем у пожилых людей [52]. Мероприятия по замедлению старения нуждаются в методиках объективной оценки их эффективности. Как обсуждается в литературе, одними из лучших предикторов продолжительности жизни и биологического возраста являются анализ метилирования ДНК и «индекс хрупкости», в то время как анализ по длине теломеров менее предсказателен [53]. По нашему мнению, более широкое дополнение традиционных критериев биологического возраста биохимическими показателями крови и анализом естественных жидкостей человека может облегчить постановку диагноза и помочь практикующим врачам получать простые показатели, отражающие динамику параметров биологического возраста для понимания состояния здоровья пациента на молекулярном уровне, для раннего распознавания и лечения заболеваний у пожилых пациентов.

СТАРЕНИЕ СОСУДОВ И НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Один из показателей биологического возраста – это состояние нервной и сердечно-сосудистой систем, способность сосудов реагировать на стресс и изменения физической активности [1]. Под давлением наследственных факторов и факторов окружающей среды плотность капиллярной сети на единицу объема с возрастом снижается. Это связано с увеличением массы тела и естественным снижением экспрессии факторов роста, регулирующих рост сосудов. Уменьшение количества нейронов и синоптических связей, регулирующих вазомоторный ответ сосудов, приводит к уменьшению максимального размера просвета капилляров и ослабляет реакцию на стресс [54]. Недавно показано, что тромбоспондин-4 (THBS4) и SPARCL1 содержатся в высоких концентрациях в сыворотке крови молодых мышей, и их концентрация с возрастом снижается. Уровень этих факторов напрямую определяет образование синапсов в культивируемых нейронах, что предполагает их важную роль в поддержании функционирования нервной системы [55]. Факторы, связанные с регенераций нервных тканей, представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Факторы, влияющие на регенерацию нервной ткани

Table 1. Factors affecting the regeneration of nervous tissue

ФАКТОРЫ	РОЛЬ В РЕГЕНЕРАЦИИ	ВД*
THBS4, SPARCL1	Поддерживают образования синоптических связей.	-
NGF	Регулирует развитие и поддержание центральных холинергических нейронов, симпатических и сенсорных периферических нейронов. Поддерживает уровень тестостерона через стимуляцию секреции гонадотропин-рилизинг-гормона. Низкий уровень в крови – индикатор риска болезни Альцгеймера.	-
ЛИПОФУСЦИН	Маркер поврежденных митохондрий в стареющих клетках. Присутствие в плазме крови отражает риск нейродегенеративных заболеваний.	+

Примечание. ВД*– возрастная динамика. Увеличение количества в плазме крови с возрастом (+), уменьшение с возрастом (-).

 

Фактор роста нервов (NGF) – нейротрофический фактор, который регулирует развитие и поддержание центральных холинергических нейронов, симпатических и сенсорных периферических нейронов [56]. Системное снижение уровня NGF связано с ухудшением когнитивных функций и риском развития болезни Альцгеймера [57]. Также показано, что назальное введение NGF может резко увеличить концентрацию тестостерона в сыворотке у стареющих животных. Лечение NGF было предложено в качестве потенциальной терапии возрастного гипогонадизма. NGF увеличивает активность нейронов гипоталамуса и стимулирует секрецию гонадотропин-рилизинг-гормона, что значительно повышает сексуальную мотивацию, улучшает качество спермы и восстанавливает фертильность стареющих животных [58]. Накопление с возрастом липофусцина (lipofuscin) является одним из важных признаков старения, что было предложено как тест на старение сосудистой и нервной системы [59]. Липофусцин – продукт неполной лизосомной деградации поврежденных митохондрий, аутофлуоресцентный липопигмент, образованный липидами, металлами и неправильно свернутыми белками. С возрастом липофусцин откладывается вокруг нервных клеток, в клетках сердечной мышцы и кожи. Липофусцин был предложен как универсальный маркер, ассоциированный с возрастом и отражающий дисфункцию митохондрий в связи с повреждением свободными радикалами. Маркер возможно детектировать в плазме крови или слюне, и он отражает риск нейродегенеративных заболеваний [59, 60].

Наряду с гормональными изменениями, рассогласование ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, нарушение роста и регуляции сосудистой сети также вызывают снижение мышечной активности, повышение свертываемости крови и артериального давления. Кроме того, снижение концентрации гемоглобина в эритроцитах приводит к гипоксическим нарушениям в периферических тканях, что увеличивает вероятность патологических нарушений в организме. Общее ослабление иммунного ответа, старение иммунных клеток и снижение кровоснабжения тканей вызывают хронические очаги инфекции. Это приводит к повреждению сосудов, что изменяет биохимические показатели плазмы крови, в частности усиливает секрецию воспалительных факторов (см. ниже). Повышение концентрации маркеров воспаления в плазме крови также связано с повреждением нервной и сердечно-сосудистой систем и может значительно сократить продолжительность жизни. Связанное с возрастом накопление метаболитов в крови может усилить воспалительный ответ, что также часто приводит к повреждению сердечно-сосудистой системы и нарушению функции почек.

СТАРЕНИЕ РЕГЕНЕРАЦИОННОЙ СИСТЕМЫ

Во время старения происходят метаболические изменения, которые в совокупности с повышенным воспалительным фоном приводят к снижению способности тканей к регенерации и восстановлению, вызывая развитие старческих заболеваний (таблица 2). Снижение концентрации GDF11, PDGF-AB, VEGF, FGF2, поддерживающих регенерационную способность центральной нервной системы, сосудов, сердца и скелетных мышц, приводит к постепенной деградации этих тканей [61–63]. В то же время увеличение катаболических факторов, таких как GDF8, активин A, приводят к замедлению регенерации тканей сердца и скелетных мышц, снижая способность к регенерации в ответ на травматическое воздействие [64, 65]. В молодом возрасте в циркуляции крови присутствуют факторы, которые способствуют росту костной ткани. Недавно обнаружено, что GDF11 участвует в росте и регенерации костной ткани через активацию сигнального пути BMP [66]. Также недавно показано участие белка апелин в регенерации скелетной мускулатуры. Возможный механизм связан с увеличением синтеза белка и деления митохондрий. Более того, апелин стимулирует аутофагию и включает антивоспалительные сигнальные пути. Его содержание в крови снижается с возрастом, что является одной из причин возрастной мускулярной дистрофии [67]. Также апелин способствует гематопоэзу, в частности показана его вовлеченность в дифференцировки гранулоцитов – клеток, осуществляющих фагоцитоз и воспалительную функцию [68, 69].

 

Таблица 2. Факторы, влияющие на регенерацию тканей

Table 2. Factors affecting tissue regeneration

ФАКТОРЫ	РОЛЬ В РЕГЕНЕРАЦИИ	ВД*
APELIN	Увеличивает продолжительность жизни мышей, способствует синтезу белка, делению митохондрий и регенерации скелетной мускулатуры. Участвует в дифференцировке гранулоцитов.	-
GDF11, PDGF-AB	Позитивно влияет на регенерацию ЦНС, сосудов, сердечной и скелетной мускулатуры, участвует в регенерации и развитии костной ткани.	-
GDF15	Индикатор старения митохондрий и уровня клеточного энергоснабжения. Также повышается при клеточном стрессе.	+
ACTIVIN A, GDF8	Замедляет регенерацию мускулатуры, в результате чего возникает мускульная дистрофия.	+
CADHERIN13	Подавляет дифференциацию остеокластов и уменьшает потерю костной массы, связанную с остеопорозом и возрастом.	-
ОКСИТОЦИН	Поддерживает регенерацию мускулатуры, печени, заживление тканей.	~
ГОРМОН РОСТА	Запускает метаболические процессы, участвует в росте и развитии тканей организма.	-
ENAMPT	Увеличивает синтез NAD+, улучшает когнитивные функции, регенерацию и увеличивает продолжительность жизни у животных.	-

Примечание. ВД* – возрастная динамика. Увеличение количества

в плазме крови с возрастом (+), уменьшение с возрастом (-);

~ индуцируется при регенерации тканей и снижается с возрастом.

 

Также обнаружено, что в плазме молодых животных содержится значительное количество Cadherin-13. Предполагается, что Cadherin-13 служит в качестве рецептора-ловушки для RANKL, запускающего развитие остеокластов. В пожилом возрасте уровень Cadherin-13 в плазме снижается, что усиливает RANKL-зависимое развитие остеокластов и деградацию костной ткани активированными остеокластами [70].

К сожалению, прямо измерить способность к регенерации трудно, так как большинство событий по регенерации тканей имеет локальный характер и происходит как ответ на повреждение. Изменения концентрации некоторых важных факторов с возрастом не наблюдается, и лишь после получения повреждения сила регенерационного ответа в молодом и пожилом организме может быть оценена в полной мере. Зависимое от возраста снижение уровня гормона роста и окситоцина приводит к замедлению роста и развития всех систем организма, включая процессы регенерации. С возрастом снижение чувствительности к инсулину приводит к нарушению питания регенерирующих и иммунных тканей, в то время как хроническое воспаление повышает расход энергии и вызывает повреждение митохондрий. В результате клетки теряют способность отвечать на метаболические ростовые стимулы [71]. В норме в здоровой клетке митохондрии вырабатывают супероксиддисмутазу (СОД), которая активно нейтрализует образующиеся в ходе жизнедеятельности свободные радикалы ROS (reactive oxygen species). Регенерация тканей – это исключительно энергозатратный процесс, требующий деления и дифференцировки клеток и синтеза белка. В ходе регенерации под воздействием ростовых факторов (гормона роста, окситоцина, IGF1 и инсулина) происходит активация метаболических сигнальных путей внутри клетки (mTOR, TORC), что одновременно повышает не только синтез белка, но и расход быстрых углеводов и запасание жиров. Высокая активность комплекса mTOR снижает аутофагию, митофагию и продукцию СОД, что уменьшает количество функциональных митохондрий, снижает защиту клеток от повреждений свободными радикалами [72]. В молодом возрасте при высокой чувствительности к инсулину процесс активации метаболизма происходит быстро. Иммунная система эффективно удаляет поврежденные клетки. Высокий синтез СОД и других антиоксидантов быстро снижает концентрацию ROS, что защищает митохондрии и другие внутриклеточные органеллы от повреждений. В пожилом возрасте стареющие (сенесцентные) клетки находятся в воспалительном состоянии и синтез СОД хронически снижен. Это приводит к повышению уровня ROS и повреждению митохондрий и клеток, в то время как процесс регенерации замедлен в связи с низким уровнем гормона роста и окситоцина, а также в связи с нарастающей резистентностью к инсулину [73, 74]. В совокупности повышенная метаболическая активность отдельных воспаленных клеток при нарушении функции митохондрий, недостаточная концентрация защитных окислительно-восстановительных молекул (например, H2S) [75, 76] приводят к старению значительного пула клеток. Недавно было показано, что уровень в циркуляции крови growth differentiation factor 15 (GDF15) может служить индикатором дисфункции митохондрий и производства клеточной энергии [77], а также сигнализировать об ускоренном старении [18].

Кроме того, процессы регенерации приводят к значительному расходу NAD+. С возрастом концентрация NAD+ в плазме крови снижается в два раза каждые 20 лет [78]. Возможно, это связано с накоплением хронически воспаленных сенесцентных клеток, которые активно расходуют NAD+ [79]. С возрастом также снижается продукция eNAMPT (secreted extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase). В результате падения концентрации eNAMPT снижается продукция NAD+ в плазме. eNAMPT секретируются во внеклеточных визикулах. Было показано, что искусственное повышение уровня eNAMPT приводит к улучшению регенерации, повышению когнитивной функции и увеличению продолжительность жизни у мышей [80]. Снижение доступности NAD+ приводит к недостаточной метаболической активности здоровых клеток и замедлению эффективной регенерации тканей [81]. Все эти события, включая клеточное старение, дополнительно запускают патологические процессы, накопление стареющих клеток, снижение регенерации и развитие возрастных нарушений [82, 83]. Факторы, влияющие на регенерацию тканей, отражены в таблице 2.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ВОЗРАСТ

Свой вклад в скорость старения также вносят старение иммунной системы, определяющей иммунологический возраст человека, снижение функциональной способности клеток иммунной системы и гуморального иммунного ответа. В то же время с возрастом количественно и качественно снижается производство специ-фичных антител в ответ на иммунизацию. Снижается производство наивных Т-клеток. Обедняются эпитопы Т-клеточного рецепторов, созревших Т-клеток; увеличивается количество истощенных и стареющих клеток иммунной системы; снижется фагоцитирующая способность клеток. Возрастные изменения в состоянии здоровья можно обнаружить по анализам иммунных клеток и КСБМ в плазме крови.

ПРОЦЕССЫ, ПРИВОДЯЩИЕ К СТАРЕНИЮ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

В 2020 году мир столкнулся с пандемией новой коронавирусной инфекции, и проблема контроля и снижения заболеваемости вышла на первый план. Ключевыми факторами стали нагрузка на систему здравоохранения, отсутствие вакцины и высокие показатели смертности среди пожилых людей. COVID-19, вызываемый вирусом CovSARS-2 с высокой степенью контагиозности, поражает наиболее уязвимые слои населения, а именно: людей с повышенным индексом массы тела, хроническими и старческими заболеваниями, такими как диабет, сердечно-сосудистые, аллергические, аутоиммунные, онкологические заболевания, иммунодефициты, заболевания крови. Также факторами риска являются возраст, курение [84] и превышение биологического возраста над календарным [20]. Кроме того, было обнаружено, что лекарственные препараты, замедляющие старение и убивающие стареющие клетки организма (сенолитики), могут снижать тяжесть течения COVID-19 и даже способны бороться с гипервоспалительной реакцией – «цитокиновым штормом» [85]. Некоторые составляющие биологического возраста приводят к увеличенной уязвимости пожилых людей. Например, недавно было показано, что с возрастом увеличивается экспрессия гена ACE2, через который вирус проникает в клетки эпителия легких [86]. Кроме общего снижения физиологических реакций, процессов заживления, восстановления и регенерации, существенный вклад в эту уязвимость вносит старение непосредственно иммунной системы. Иммунное старение можно определить как снижение активности иммунной системы и развитие неспособности осуществлять свою функцию. Иммуностарение можно описать в нескольких основных процессах (рисунок 1). Прежде всего, это снижение продукции молодых предшественников иммунных клеток, пролиферативного потенциала иммунных клеток, клеточного разнообразия, репертуаров распознавания антигенов, накопление клеток со сниженной функцией и реакцией на стимулы, стареющих клеток памяти, снижение фагоцитоза и накопление сенесцентных клеток с хроническим воспалительным фенотипом.

 

Рисунок 1. Процессы старения иммунной системы. Слева – молодая иммунная система, справа – иммунная система пожилых людей.

 

А. Костный мозг в молодости продуцирует большое количество предшественников Т-клеток (предшественники тимоцитов) с громадным количеством паттернов распознавания чужеродных антигенов. Большое количество предшественников поддерживает архитектуру тимуса. Тимус производит громадное количество наивных Т-клеток. В пожилом возрасте производство предшественников Т-клеток снижается, что наряду с генетическими причинами приводит к деградации (инволюции) тимуса [87, 88]. Снижение рекомбинации в Т-клеточном рецепторе в костном мозге и снижение эффективности негативной селекции в тимусе приводят к уменьшению количества наивных Т-клеток и к ограниченному количеству паттернов Т-клеточных рецепторов, что снижает возможность распознавания внутриклеточных инфекций.

Б. У молодых остается высокая способность распознавать новые антигены (левая панель), лимфоциты легко активируются и обладают большим потенциалом пролиферации, что приводит к образованию клеток памяти с высоким потенциалом к пролиферации. Лимфоциты пожилых людей способны реагировать и уничтожать известные организму инфекции, но с трудом способны образовывать новые Т-клетки для новых антигенов. С возрастом в организме накапливается большее количество истощенных (слабопролиферирующих) и сенесцентных клеток памяти.

В. В молодом возрасте костный мозг производит большое количество предшественников наивных В-клеток, реагирующих на стимуляцию инфекционных антигенов секрецией большого количества слабоаффинных антител (IgM). Эти антитела обеспечивают, с одной стороны, пассивную неспецифическую защиту от инфекций, а с другой стороны – маркируют стареющие клетки для стимуляции фагоцитоза макрофагов. Кроме того, высокий уровень рекомбинации в созревающих клетках во время инфекции обеспечивает эффективное переключение классов антител IgM -> IgG (показано красной стрелкой) и высокий уровень секреции антител (IgG) с громадным разнообразием специфичности к поверхностным маркерам инфекционных агентов (вирусов, бактерий и т.д.). В пожилом возрасте костный мозг снижает производство предшественников, что является одним из факторов дезорганизации структуры селезенки и лимфатических узлов (лимфоидные органы), где B-клетки созревают [89]. В результате снижается производство как специфичных (IgG), так и неспецифичных антител (IgM).

Г. В молодом возрасте присутствует большое количество фагоцитирующих клеток, удалявших клеточный мусор, бактериальные инфекции, а также стрессированные, поврежденные, мутировавшие и стареющие клетки. Поддерживается высокая вероятность апоптоза клеток после повреждения. В пожилом возрасте эффективность фагоцитоза снижается, происходит накопление стареющих клеток и клеточного мусора. Сенесцентные клетки приобретают SASP (находятся в воспаленном состоянии и секретируют воспалительные факторы). Воспалительная реакция сенесцентных клеток становится хронической, при инфекции переходит в «цитокиновый шторм». Стареющие клетки оказывают негативное воздействие на окружающие ткани. В молодом организме иммунные клетки (Т-хелперы, натуральные киллеры, В-клетки, моноциты и дендритные клетки) способны быстро и со значительной амплитудой секретировать воспалительные факторы в ответ на инфекцию. Молодые иммунные клетки также способны быстро гасить производство воспалительных факторов сразу после удаления инфекции. У пожилых присутствует много пролиферативно-истощенных клеток, неспособных к адекватной секреции цитокинов в ответ на стимуляцию антигеном. В молодом возрасте присутствует богатый репертуар минорных высокоспециализированных иммунных клеток, но с возрастом их количество и разнообразие сокращаются [90].

НАКОПЛЕНИЕ СЕНЕСЦЕНТНЫХ КЛЕТОК С ВОЗРАСТОМКАК ПРИЧИНА ХРОНИЧЕСКОГО ВОСПАЛЕНИЯ

С возрастом происходит накопление сенесцентных клеток как в иммунной системе, так и по всему организму (рисунок 1, Г).Сенесцентность клетки – это выработанная в ходе эволюции реакция организма, пред-отвращающая размножение зараженных вирусом или поврежденных клеток [91]. Так, после существенного повреждения ДНК, нарушения метаболизма, блокировки иммунитета клетки или если в результате мутации или вирусного воздействия происходит гиперстимуляция клеточного деления (что приводит к истощению клетки), клетка способна уйти в апоптоз (программированную смерть) [92]. Однако, если клетка не способна уйти в апоптоз, включается программа ускоренного старения клетки (программа сенесцентности). Множество вирусов выработали способы блокировки клеточного апоптоза, чтобы использовать клетку для своего размножения [93]. Предполагается, что сенесцентность – это защитный механизм, который высшие организмы выработали в ходе эволюции в ответ на способность вирусов блокировать апоптоз [91]. При включении программы сенесцентности клетки перестают делиться и приобретают так называемый senescent associated secretory phenotype (SASP) – сенесцент-ассоциированный секреторный фенотип. Они начинают производить воспалительные цитокины, а также поверхностные маркеры, которые сообщают иммунной системе, что эту клетку надо удалить из организма. В молодом организме сенесцентных клеток мало, потому что они активно удаляются фагоцитирующими (поглощающими) клетками – так называемыми «клетками-мусорщиками», а также активно маркируются и убиваются лимфоцитами [90]. Неизвестно, почему с возрастом иммунная система постепенно перестает распознавать и удалять сенесцентные клетки. Возможно, возрастное накопление сенесцентных клеток связано с недостаточной активностью лимфоцитов по распознаванию и уничтожению больных клеток, секретирующих воспалительные цитокины. Возможно также, что снижается продукция антител, распознающих и маркирующих сенесцентные клетки, соответственно снижается способность фагоцитирующих «клеток-мусорщиков» распознавать и удалять сенесцентные клетки. Способность «клеток-мусорщиков» к фагоцитозу с возрастом также снижается [94]. Из-за этого в циркуляции крови и тканях накапливаются остатки мертвых клеток, бактерий и убитых вирусов. Все перечисленные процессы приводят, с одной стороны, к накоплению неудаленного мусора, вызывающего воспаление, а с другой – к аккумуляции сенесцентных клеток, бурно реагирующих повышенной секрецией воспалительных цитокинов во время иммунной реакции на инфекции. Так, недавно показано, что повышенный уровень TNFá в крови при ревматоидном артрите или в связи с общим подъемом воспаления в случае инфекции может вызвать септический шок с множественной дисфункцией органов. Это также вызывает повреждение миокарда и повреждение сосудов, приводящее к недостаточности крово-обращения [95]. Именно поэтому пожилые пациенты, имеющие хронические воспаления и заболевшие новой коронавирусной инфекцией COVID-19, при тяжелом ее течении чаще погибают от «цитокинового шторма». По сравнению с молодыми пожилые люди уязвимы и для других инфекционных заболеваний и более склонны к серьезным побочным эффектам [96].

Иммунодефициты проявляются из-за старения стволовых клеток крови и клеток иммунной системы, из-за снижения их пролиферативного и дифференцированного потенциала, а также из-за неспособности к возбуждению в ответ на инфекцию.

Таким образом, составляющими увеличения иммунологического возраста являются развитие хронического воспаления из-за накопления сенесцентных клеток, постепенное снижение пролиферативного и дифференцированного потенциала стволовых клеток крови, приводящее к снижению производства лимфоидных клеток и к иммунодефицитным состояниям. В совокупности это приводит к неспособности эффективно убить инфекцию и очистить организм от остатков убитых микроорганизмов [97].

Применяя меры по своевременному мониторингу и целевому восстановлению иммунной функции, отслеживая воспалительные факторы и применяя лекарственные препараты, которые контролируют воспалительную реакцию, а также используя сенолитики, можно защитить стареющее население от тяжелых побочных эффектов, сократить количество случаев преждевременной смертности даже в условиях пандемии таких заболеваний, как COVID-19.

ИНДИКАТОРЫ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО СТАРЕНИЯ

Одним из важнейшим проявлений старения иммунной системы является воспалительное старение [98]. Общий уровень воспалительной реакции может также быть связан не только с острыми и хроническими инфекциями, но и с нарушениями микрофлоры кишечника. Так, «западная диета» с обилием углеводов и жиров в продуктах питания приводит к накоплению микрофлоры, вызывающей повреждение клеток кишечника и воспалительную реакцию [99]. Это приводит к хроническому подъему в плазме крови таких провоспалительных факторов, как TNF-a, IL6, вызывая повреждение сосудов и тканей. Преобладание воспалительной микрофлоры является фактором развития диабета и артрита [99, 47]. Воспаление, вызванное инфекциями или преобладанием воспалительной кишечной микрофлоры, вызывает хроническую индукцию и истощение иммунной системы. Гиперстимуляция инсулина и факторов роста значительно активирует липидный обмен для обеспечения иммунных реакций [27]. Однако при хроническом воспалении постоянная активация метаболических сигнальных путей может приводить к нарушению самоочищения в клетках, снижению секреции ферментов, отвечающих за удаление свободных радикалов, и вызывать инсулиновую резистентность [100, 83]. Все это в совокупности вместе с повреждающим действием инфекций может приводить к клеточной дисфункции и переходу клетки в сенесцентное состояние [47, 83].

Как было сказано выше, с возрастом в крови человека увеличивается количество сенесцентных клеток, проявляющих воспалительный фенотип SASP. Этот фенотип выражается в секреции провоспалительных факторов и детектируется по секреции индикаторов накопления сенесцентных клеток, а также по высокой системной концентрации в плазме крови этих воспалительных факторов (таблица 3). Этот процесс называют воспалительным старением. Он является одним из основных проявлений старения иммунной системы, которая оказывается неспособной к эффективному удалению стареющих клеток и к быстрому гашению воспалительной реакции после удаления инфекции.

 

Таблица 3. Воспалительные и антивоспалительные факторы, связанные со старением

Table 3. Inflammatory and anti-inflammatory factors associated with aging

ФАКТОРЫ	РОЛЬ В СТАРЕНИИ	ВД*
CCL2, CCL11, CCL27	Воспаление нервной системы и привлечение эффективных клеток к месту воспаления. Значительно активируются при болезни Альцгеймера. Связаны с тяжестью течения заболеваний печени и значительно повышены у пожилых людей со стенозом аортального клапана, а также с аутоиммунными расстройствами.	+
CCL2, IL17, IL27, VWF	Воспаление сосудистого эндотелия, повреждение тканей, вызванное воспалением. Ишемическая болезнь сердца.	+
TNF, IL27	Старение гемопоэтических стволовых клеток.
IL1B, IL6, TNF, CRP	Общее острое воспаление – «цитокиновый шторм» и/или показатели возрастных воспалительных изменений.	+
IL17	Фактор периферического воспаления, связанного с адаптивной иммунной системой. Воспаление кишечника, преддиабетическое состояние, аутоиммунные заболевания, артрит, псориаз.	+
Â2 - МИКРОГЛОБУЛИН	Фактор нарастающей дисфункции почек и воспаления.	+
ICAM-1, VCAM-1, VWF	Адгезионные молекулы – индикаторы воспаления сосудов и нервных тканей.	+
НЕОПТЕРИН	Метаболит, секретируемый макрофагами типа М1. Отражает общее хроническое воспаление, воспалительный возраст природного иммунитета.	+
АПЕЛИН	Включает антивоспалительные сигнальные пути.	-
TIMP2	Антивоспалительный фактор, ингибитор металлопротеиназ, поддержание функции гиппокампа.	-
PAI-1, UPAR, LTA4, LTB4, PGD2, 5-HETE	Концентрация в плазме отражает накопление стареющих (сенесцентных) клеток с воспалительным фенотипом.	+
KALLISTATIN	Антиоксидантные свойства, предотвращение воспалительной индукции сенесцентных клеток.	-

Примечание. ВД* – возрастная динамика. Увеличение количества в плазме крови с возрастом (+), уменьшение с возрастом (-).

 

Воспалительное старение также связано с постепенным накоплением нефункциональных, сенесцентных клеток иммунной системы, приводящих к развитию иммунодефицитов в пожилом возрасте, что приводит к неполному освобождению от острых инфекций и их тенденции к переходу в хроническую фазу. Как показали многочисленные исследования, воспаление способствует развитию диабета, хрупкости костей скелета, воспалительного заболевания кишечника, артрита, воспалению нервной ткани, хронического воспаления легких и других неизлечимых заболеваний, таких как рак, болезнь Альцгеймера и рассеянный склероз [49, 98]. Также смертность от всех причин среди пожилых людей коррелирует со здоровьем полости рта. Так, воспаление десен, слизистой оболочки полости рта, пародонта связано с риском инсульта, инфаркта миокарда, ревматоидного артрита, сердечно-сосудистых заболеваний [101]. Именно поэтому анализ слюны на воспалительные факторы представляется исключительно важным.

При оптимальном состоянии иммунной системы в молодом возрасте воспалительная реакция быстро стихает, после того как возбудитель удаляется из организма. Поврежденные клетки быстро удаляются, а здоровые ткани быстро восстанавливаются. С возрастом иммунный ответ на патоген с большей вероятностью принимает хронический характер в связи с медленным удалением остатков инфекции и поверженных и стареющих клеток. Сенесцентные клетки склонны в большей амплитуде реагировать на воспаление, проявляя SASP. Так, вместе паттерны остатков неудаленных антигенов и хроническое воспаление при определенных обстоятельствах могут вызывать «цитокиновый шторм» и даже сепсис, превращаясь в неконтролируемый процесс. В подтверждение этого недавно было обнаружено, что «цитокиновый шторм» возникает уже после пика заражения COVID-19 в связи с присутствием в циркуляции крови большого количества неудаленных остатков вирусов и поверженных клеток [102].

Анализ литературы выявил ряд факторов, связанных с воспалительным возрастом. Концентрация этих факторов увеличивается с возрастом, и они в существенной степени влияют на биологический и иммунологический возраст человека. Это простагландины, хемокины, цитокины, вызывающие воспалительную реакцию и привлекающие иммунные клетки к местам воспаления, и интерлейкины, управляющие размножением иммунных клеток. Кроме того, при воспалении накапливаются метаболиты – индикаторы воспаления. Часть из них непосредственно связана с накоплением стареющих сенесцентных клеток и отражает нарастающую дисфункцию иммунной системы. При патологии или старении эти факторы не только отражают старение, но и сами вовлечены в повреждение тканей.

Воспалительные факторы. Их количество увеличивается с возрастом и в слюне, и в плазме крови. Так, увеличивается концентрация цитокинов, инициирующих воспалительный ответ (TNFá), интерлейкинов, вызывающих пролиферации иммунных клеток (IL1â, IL6, IL27), и хемокинов (CCL11, CCL27), привлекающих иммунные клетки к месту воспаления, секретирующих ферментов (матриксные металлопротеиназы), которые гидролизуют межклеточный матрикс в тканях, облегчая доступ эффективных иммунных клеток к месту воспаления, и метаболитов, участвующих в привлечении лимфоцитов к месту воспаления и их активации (таблица 3) [24]. Также обнаружено увеличение CCL11 с возрастом. Инъекции CCL11 в кровь экспериментальным животным снижали когнитивную функцию и задерживали регенерацию нервных тканей [103].

С возрастом происходит постепенное увеличение уровня секреции простагландина Prostaglandin D2 (PGD2) – основного инициатора воспаления. Высокий уровень PGD2 в легких блокирует созревание дендритных клеток, отвечающих за обучение Т-клеток, борющихся с легочными инфекциями [104]. Развитие воспалительной реакции зависит от экспрессии цитокинов, таких как TNF, и интерлейкинов IL1b, IL6, которые в свою очередь запускают работу хемокинов по привлечению воспалительных клеток к месту воспаления [105]. Хронический подъем экспрессии стареющих тканей хемокинов CCL2, CCL11, CCL27 приводит к хроническому присутствию макрофагов типа-M1 в тканях и их повреждению. Было показано вовлечение CCL2 в остеопороз [106], в патогенез болезни Альцгеймера и снижение когнитивной функции [107]. Также уровень CCL2 является индикатором биологического возраста и предлагается как показатель уровня хрупкости организма в пожилом возрасте [108]. Уровень CCL27 значительно повышен при пародонтозе в слюне пожилых людей [109] и при аутоиммунных заболеваниях кожи [110, 111]. Экспрессия CCL27 нарушена в тканях при диабете. Отсутствие CCL27 снижает привлечение T-клеток к поврежденным тканям, что является одной из причин плохого заживления тканей при диабете [112].

У пожилых людей вырабатывался более высокий IL17, особенно во время иммунного ответа на системную инфекцию. Так, секретируемый нейтрофилами IL17 приводит к повреждению печени и гибели инфицированных вирусом старых модельных мышей [113]. Повышенный уровень в плазме крови IL17 является фактором риска ишемического церебрального инсульта (атеросклеротического инфаркта головного мозга) и вызывает сенесцентность эндотелиальных клеток [114]. Повышенный уровень IL17 является одной из причин псориаза, TNF-независимого ревматоидного артрита [115], воспалительного заболевания кишечника [116] и диабета [117].

Возрастные изменения иммунной системы приводят к снижению ее способности производить сбалансированное количество лимфоидных и миелоидных клеток. В многочисленных публикациях показано смещение баланса в сторону развития миелоидных клеток [118]. Такое смещение является результатом воспалительного повреждения гемопоэтических стволовых клеток через TNF-зависимое повышение уровня IL27-рецептора и повышение уровня его лиганда IL27 в плазме крови [119, 120]. Высокий уровень IL27 в крови связан с риском развития ишемической болезни сердца и воспалением сосудистого эндотелия [121].

Секретируемые адгезионные молекулы, обладающие антиадгезионными свойствами. При нормальной иммунной реакции секреция этих молекул призвана снижать иммунную активность в воспаленных тканях, блокируя адгезию иммунных клеток в месте воспаления. Однако в случае хронического воспаления уровень растворимых (секретируемых) адгезионных молекул в плазме крови повышается. Повышение уровня растворенных адгезионных молекул, таких как ICAM-1, VCAM-1, свидетельствует о воспалении сосудистого эндотелия. VCAM-1 является индикатором предрасположенности к нейродегенеративным заболеваниям, связан со снижением функции гиппокампа и общим ухудшением здоровья [122]. Высокая концентрация ICAM-1 в норме свидетельствует о снижении иммунной реакции, но при хроническом увеличении в плазме крови с возрастом говорит об общем ухудшении здоровья и связана с «индексом хрупкости» [123].

Растворимый vWF является склеивающим белком при тромбировании крови. Повышение его концентрации в крови сигнализирует о повреждении сосудов, хроническом эндотелиальном воспалении и повышении риска кровоизлияния [124]. vWF, хронически активируя поверхность сосудистого эндотелия, увеличивает риск образования атеросклеротических бляшек [125]. Кроме того, vWF считается прогностическим маркером заболеваний, связанных с возрастом, таких как предынфарктное, предынсультные состояния, инсульт, диабет и острая воспалительная реакция [124].

Наиболее распространенный индикатор хронического воспаления – это С-reactive protein (CRP). CRP – белок, участвующий в образовании комплекса комплемента, который связывается с антителами, опсонизирующими вирусы, бактерии, гельминты, а также клетки, находящиеся в предаппототическом или сенесцентном состоянии, и инициирует комплемент-зависимый лизис таких объектов [126]. Его концентрация в крови является индикатором повышенной лизирующей активности в организме человека. Острое повышение его концентрации обычно связано с воспалительной реакцией в ответ на инфекции. Кроме того, его хроническое повышение, связанное с возрастом, может быть индикатором множества расстройств, таких как старческая мускулярная дистрофия [127], онкологические заболевания [128], преддиабетическое состояние [129], нейродегенеративные заболевания и снижение когнитивной функции [130].

Некоторые метаболиты способны быть индикаторами как острого, так и хронического воспаления, связанного с возрастом. Например, компонент иммунокомплекса на Т-клетках белок â2 – микроглобулин (B2M) увеличивается в концентрации во время воспаления, и его подъем связывают как c риском смерти от сердечно-сосудистых заболеваний и хронического воспаления [131], так и с развитием общей немощности и хрупкости организма [132]. Плазма крови старых животных, содержащая большое количество В2М, способна привести к повреждению мышечных тканей и гиппокампа у экспериментальных животных [133].

Неоптерин – метаболит, секретируемый макрофагами во время воспаления. Его уровень также повышается с возрастом в связи нарастанием хронического и связанного с возрастом воспаления в тканях [134].

ФАКТОРЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ

Понимая значение противовоспалительных препаратов для преодоления воспалительного старения, поиску таких субстанций ученые уделяют особое внимание. В исследованиях даже дискутируется использование выделений паразитических гельминтов в качестве антивоспалительных агентов [135]. Поиск новых факторов, контролирующих воспалительную реакцию, снижающих количество и воспаление сенесцентных клеток или сообщающих о наличии воспаления, является приоритетной задачей в ближайшей перспективе.

Сравнение плазмы крови молодых и старых животных, а также исследования плазмы пуповинной крови человека показали обильное содержание противовоспалительных факторов у молодых. Например, ингибиторы матриксных металлопротеиназ, обладая противовоспалительными свойствами, снижают воспалительную реакцию в очищенных от инфекции тканях, таким образом завершая иммунный ответ. Ингибитор матриксных металлопротеиназ TIMP2 присутствует в больших количествах в плазме крови новорожденных. Например, при инъекции TIMP2 в кровь старых мышей наблюдается снижение воспаления и восстановление функции гиппокампа [136]. Белок апелин, содержащийся в высокой концентрации в молодой крови, контролирует антивоспалительные каскады. Он способен подавлять воспаление нервных тканей [137] и защищать от токсического повреждения инфекционными агентами [138].

Каллистатин (Kallistatin) является членом суперсемейства ингибиторов сериновых протеиназ (серпинов). Он защищает от повреждения сосудов, обладая антивоспалительными свойствами и подавляя окислительный стресс. Каллистатин значительно уменьшает TNF-á-индуцированное старение клеток сосудистого эндотелия человека, понижает активность â-галактозидазы (внутриклеточного маркера старения клеток) и экспрессии ингибитора-1 активатора плазминогена (PAI-1), а также стимулирует работу антиоксидантных ферментов. Эти исследования in vitro и in vivo дают важную информацию о роли и механизме каллистатина в предотвращении сосудистого старения и сенесцентности клеток [139].

ИНДИКАТОРЫ СЕНЕСЦЕНТНЫХ КЛЕТОК

Присутствие сенесцентных клеток в тканях тестируют с помощью нескольких маркеров. Основной параметр сенесцентности – остановку клеточного деления – определяют по окрашиванию на экспрессию ингибиторов деления p16^INK4a, p21^CIP1. Также сенесцентные клетки обычно детектируют по возрастанию активности фермента â-галактозидазы. Однако эти маркеры присутствуют на определенных стадиях и в нормальных клетках, поэтому они не являются строго специфичными маркерами сенесцентности клеток. Только использование нескольких маркеров одновременно – сенесцент-ассоциированной â-галактозидазы, отслеживание перемещения ядерного белка HMGB1 в межклеточное пространство и мониторинг увеличения фосфорелирования гистона ãH2AX в ядре (индикатора повреждения ДНК), а также измерение увеличения размера клеток – дает надежные результаты определения сенесцентных клеток [140]. Но такие сложные исследования могут проводиться в рамках высокотехнологичных лабораторий. Тем не менее анализ некоторых циркулирующих факторов может дать интегральную оценку количества сенесцентных (стареющих) клеток в организме.

После включения программы сенесцентности клетка начинает выделение ряда воспалительных факторов и металлопротеиназы для облегчения клеткам иммунной системы распознавания и проникновения к воспаленным клеткам для их удаления. Сенесцентные клетки, включая сенесцентно-ассоциированный секреторный фенотип (SASP), выделяют провоспалительные цитокины (IL1b, IL6, TNFa) и хемокины (CCL2, CCL3), вызывая локальный иммунный ответ для подробного анализа причин воспаления и сенесцентности. Также сенесцентность наступает в том числе и при повреждении клеток инфекционными агентами [83]. При снижении функционирования иммунной системы и в связи с возрастом происходит аккумуляция сенесцентных клеток в тканях организма. Накопление сенесцентных клеток с возрастом поднимает общий базовый уровень воспаления организма. Такой негативный воспалительный фон при сниженной амплитуде иммунной реакции приводит к повреждению окружающих тканей, а также является фактором риска развития диабета, сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [48].

Провоспалительные факторы, выделяемые сенесцентными клетками, производятся и здоровыми иммунными клетками и тканями во время ординарной иммунной реакции. Именно сенесцентные клетки придают организму системный хронический характер. Исследования специфических факторов, сигнализирующих о накоплении именно сенесцентных клеток, – это исключительно важная задача, направленная на предсказание возрастных изменений и рисков развития заболеваний, связанных с возрастом. Как было недавно показано, концентрация PAI-1 и uPAR факторов в крови тесно связана с накоплением сенесцентных клеток в организме и может быть надежным индикатором нарастания возрастного воспаления в периферических тканях. Они также являются важными индикаторами воспалительного процесса в нервных тканях, приводящего к снижению когнитивной функции [141, 18].

Кроме того, оказалось, что простагландины – факторы, включающие воспалительную реакцию, – также оказались способны включать программу сенесцентности у дендритных клеток и в клетках других тканей организма. Это значительно снижает эффективность локального иммунного ответа из-за дисфункции дендритных клеток [104].

Тестирование факторов старения – исключительно важный анализ для медицины 21 века. Человечество снизило вероятность смерти от инфекций, используя прививки и антибиотики, антивоспалительные препараты и гигиену. Препараты, нормализующие кровяное давление, современная малоинвазивная хирургия и внедрение коронарного стентирования в совокупности продлили трудоспособный возраст на 5–10 лет. Такой значительный скачок в увеличении продолжительности жизни привел к увеличению пенсионного возраста и поднял планку для дальнейшего продления активного трудоспособного долголетия в развитых странах в условиях сокращения рождаемости. Повышение продолжительности жизни также вызвало переход стареющего населения в новую возрастную зону старческих заболеваний (диабет, заболевания опорно-двигательного аппарата, онкологические и нейродегенеративные заболевания, а также заболевания, для которых наука еще не создала эффективных способов лечения). Меры по мониторингу показателей крови и соблюдение здорового образа жизни позволят сократить расходы на медицинское обслуживание, предупреждая болезни, и замедлить на ранних стадиях развитие опасных заболеваний. Введение понятия «гигиена здоровья и долголетия» повлечет за собой разработку методов мультиплексного мониторинга объективных показателей состояния организма.

КОНВЕНЦИОНАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА КСБМ

За последний год в связи с угрозами, вызванными вирусом COVID-19, только за первые 3 месяца эпидемии было опубликовано более 500 научных работ, предлагающих методы тестирования вирусных белков и факторов воспаления, и их количество продолжает расти. Некоторые конвенциональные (традиционные) методы анализа КСБМ могут быть приспособлены для индивидуального применения, совмещены с мобильными устройствами для анализа результатов и дистанционной обработки с выдачей рекомендаций пациенту и лечащему врачу (рисунок 2).

 

Рисунок 2. Конвенциональные методы анализа КСБМ.А. Иммуноферментный анализ. Б. Иммунохроматографический анализ. В. Метод биолюминесцентного анализа комплементации фрагментов белка.

 

А. Иммуноферментный анализ. Захватывающие антитела к исследуемому белку прикрепляются к поверхности 96-луночной плашки, после экспозиции разбавленной плазмы крови исследуемый белок (или метаболит) прикрепляется к аффинной части захватывающих антител. После отмывки излишков плазмы добавляют детектирующие антитела, меченные ферментом, способным гидролизовать субстрат, так что он приобретает цветную окраску (HRP- horseradish peroxidase, фермент-пероксидаза, выделенный из хрена). Окраску детектируют оптическими методами. Захватывающие антитела и детектирующие антитела имеют разный эпитоп распознавания на исследуемом белке, что позволяет им не конкурировать за связывание.

Б. Иммунохроматографический анализ. C током буферной жидкости образец плазмы крови растворяет меченые антитела, которые захватывают из плазмы исследуемый белок (антиген). На тестовой полоске прикреплены схватывающие антитела, аффинные к альтернативному эпитопу исследуемого белка. Комплекс меченых антител, захвативших антиген, задерживается на тестовой полоске. Накопление окраски на тестовой полосе наблюдается визуально. С током буферной жидкости избыток несвязавшихся меченых антител захватывается на контрольной полоске антителами, аффинными к меченым антителам. Незахваченные загрязняющие антигены смываются в накопительную подушку.

В. Метод биолюминесцентного анализа комплементации фрагментов белка. Два антитела, меченные разными рекомбинантными фрагментами люциферы, связываются с разными эпитопами исследуемого белка. В результате такого связывания двух разных антител с антигеном происходит объединение двух рекомбинантных доменов фермента люциферы. Происходит восстановление ее функциональности, и фермент окисляет субстрат, превращая его в флуоресцентный. Концентрация исследуемого антигена определяется в темноте визуально по интенсивности флуоресценции. Низкие концентрации детектируют с помощью считывающих устройств.

Рассмотрим перечисленные методы анализа подробнее.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

Наиболее наглядным и не требующим сложного оборудования является иммуноферментный анализ. Он позволяет оценить КСБМ в плазме крови с помощью цветной ферментной реакции. Единственным ограничением этого анализа является наличие высокоафинных антител к исследуемому белку или метаболиту.

Иммуноферментный анализ (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) широко применяется при анализе КСБМ, когда концентрация таргетного протеина или метаболита варьирует в значительной степени (рисунок 2А). Это лабораторный иммунологический метод качественного или количественного анализа, который используется для широкого круга низкомолекулярных соединений, макромолекул, цитокинов, гормонов, а также поверхностей вирусных белков и пр. В основе метода лежит специфическая реакция «антиген – антитело». Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента, который разлагает субстрат. Этот субстрат после разложения приобретает цвет и оседает вокруг антитела с исследуемой молекулой, что используется для количественной регистрации сигнала. Также предпринимаются попытки расширить количество одновременно детектируемых белков плазмы, используя мечение антител к разным белкам несколькими флуоресцентными маркерами [142].

Иммуноферментный анализ может быть использован для нескольких белков и метаболитов. Пространственное разнесение связывающих антител в виде нанесенных точек или полосок, а также применение антител, меченных разными гидролизующими ферментами с последующей последовательной окраской разными субстратами, позволяют детектировать 2-3 КСБМ одновременно. Использование стационарных фоторегистрирующих устройств и даже в некоторых случаях фотокамеры мобильного телефона позволяет детектировать даже мелкие и плотно расположенные цветные объекты. Современное программное обеспечение и мобильные приложения могут оценивать интенсивность окраски, проводя грубую оценку количества исследуемого белка и даже скорость накопления окраски при серийном фотографировании. Серийное фотографирование и анализ контрольных полосок дают возможность проводить не только качественный, но и высокоточный количественный анализ. Чувствительность ELISA в большинстве коммерческих продуктов достигает 3–5 пг/мл. При применении методов амплификации, таких как биотин-стрептовидин с использованием дополнительных промежуточных антител или амплификации тирамидами, можно увеличить чувствительность определения КСБМ до 100 раз [143]. Однако это существенно удорожает анализ, увеличивает трудозатраты и повышает требования к специфичности антител для предотвращения неспеци-фичных сигналов.

ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Одним из распространенных и популярных методов анализа КСБМ, применяемых в индивидуальных тестовых системах, является иммунохроматографический анализ – ИХА (Immunochromatographic assay, ICA, or lateral flow analysis, LFA). Этот относительно дешевый метод может быть использован для быстрого анализа даже в домашних условиях, именно поэтому его широко используют для производства тестовых систем (рисунок 2Б).

В качестве метки для антител наиболее часто используется коллоидное золото. Антитела конъюгируют с частицами коллоидного золота, далее меченые частицы коллоидного золота центрифугированием отделяют от абсорбированных его антител [144]. После помещения сыворотки крови или слюны на тестовую полоску, на которую предварительно нанесены антитела с коллоидным золотом, происходит образование иммунокомплексов (связывание антител с антигеном, например с белком-цитокином). Двигаясь с капиллярным фронтом жидкости, иммунокомплексы встречают на пути прикрепленные к подложке антитела антигены, но прикрепленные к его альтернативному эпитопу (к другой части белка-цитокина). Таким образом происходит накопление антител с коллоидным золотом в виде цветной полоски, которую можно распознать визуально (рисунок 2Б).

В качестве модификаций используют различные способы мечения захватывающих антител, включая ферменты HRP или AP, или флуоресцентные метки. ICA – простой метод с минимальными требованиями к подготовке жидкого образца, где результат может быть получен за 5–20 минут после нанесения пробы. ICA имеет большой потенциал для массового первичного скрининга, и именно поэтому он имеет серьезное конкурентное преимущество по сравнению с другими аналитическими методами.

Недостатком метода является невысокая (100–400 pg/ml) чувствительность по сравнению с диагностикой ПЦР (полимеразная цепная реакция), поэтому наибольшее распространение он получил при тестировании крупных белков, таких как повторяющиеся белки вирусных капсидов или поверхностных молекул бактерий. Только в анализе таких объектов множественное прилипание антител, помеченных коллоидным золотом, дает достаточную для визуальной диагностики окраску. Однако этот метод имеет большой потенциал. Например, чувствительность может быть повышена в несколько раз при применении амплификации размеров частиц коллоидного золота [144]. Также для мечения антител предлагается использовать углеродные нанотрубки. Некоторые авторы утверждают, что после преодоления гидрофобности нанотрубок и использования нековалентного способа конъюгации можно поднять визуальное распознавание сигнала в ~10 раз и таким образом детектировать вещества, растворенные в плазме крови с разрешением 63 нг/мл при использовании ИХА [145].

Применение других чувствительных методов окраски (иммуноферментной, люминесцентной, флуоресцентной) также весьма перспективно для ICA, но требует создания простых устройств для считывания динамики накопления сигнала.

МЕТОД БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА КОМПЛЕМЕНТАЦИИ ФРАГМЕНТОВ БЕЛКА (PCA)

Детекция концентрации малых молекул, включая цитокины, осуществляется методом биолюминесцентного анализа комплементации фрагментов белка (protein-fragment complementation assay, PCA)(рисунок 2В). Изначально метод применялся для исследования ассоциации белков между собой. В ходе дальнейших исследований, после ковалентного присоединения к антителам двух частей люциферы, удалось применить метод для детекции КСБМ прямо в растворе или в стабилизованной плазме крови. N-концевая производная (LnBiT) и два С-концевых пептида с 11 остатками (LcBiT и SmBiT) соответствуют последовательным бета-цепям, с которыми VH и VL цепи были слиты и экспрессированы в клетках Escherichia coli. Путем оптимизации условий реакции и пептидной последовательности удалось повысить эффективность комплементации люциферазы, и в результате антиген-остеокальциновый пептид может быть обнаружен с низким фоновым сигналом. При добавлении субстрата комплекса «антиген – антитела» люцифераза дает яркое световое излучение. Яркость достигает 88% от излучения при использовании люциферазы дикого типа. В недавних публикациях сообщается о возможности видеть яркое свечение люминофора прямо в капле жидкости даже невооруженным глазом при анализе методом OS-BLIA [146]. Именно поэтому этот тип детекции, называемый авторами «метод открытого сэндвича – биолюминесцентного иммуноанализа» (OS-BLIA), может стать основой многих систем обнаружения непосредственно в местах оказания медицинской помощи. PCA способен детектировать присутствие КСБМ (например цитокинов) с высоким разрешением. Однако, к сожалению, этот анализ трудно применить в мультиплексном варианте, так как в одном объеме может быть измерена концентрация только одного антигена ввиду уникальности люциферазной реакции. Кроме того, обычно для количественного анализа флуоресценции необходимы специальные фоторегистрирующие устройства.

СОВРЕМЕННЫЕ МУЛЬТИПЛЕКСНЫЕ ВИДЫ АНАЛИЗА

Мультиплексные (многоканальные) методы анализа стали возможны после разработки методов мечения антител различными маркерами, которые возможно детектировать с достаточной точностью, одновременно различая наличие метки разных близко расположенных антител и их концентрацию в заданном объеме. Эти методы могут применяться только в высокотехнологичной лаборатории, оборудованной современными приборами, такими как многоканальные проточные цитометры, масс-спектрометры, фотодетекторы спектра флуоресценции и современные высокопроизводительные секвенаторы (устройство, с помощью которого выполняется автоматизированное определение последовательности нуклеотидов в цепи ДНК – секвенирование).

Развитие мультиплексных методов связано с двумя тенденциями: пространственным разнесением детектирующих антител в микрообъеме и применением меток, которые могут быть детектированы в одном микрообъеме.

РАЗНЕСЕНИЕ ДЕТЕКТОРОВ В МИКРООБЪЕМЕ

Примерами мультиплексных методов, основанных на разнесении детектирующих антител, являются эрреи/микроэрреи с антителами, цитометрический анализ КСБМ на флуоресцентных частицах и анализы с использованием биосенсоров.

Эрреи/микроэрреи с антителами. Антитела наносятся на подложку в виде пятен со строгим пространственным расположением, где каждому пятну соответствует специфическое антитело, связывающее отдельный белок или метаболит, и интенсивность окраски соответствует концентрации соответственного белка в исходном материале (рисунок 3А).

Биосенсоры. На поверхности расположены участки с микроэлектродами, которые детектируют связывание антигенов по изменению электрического поля из-за «антиген – антитело». Для усиления используют вторичные детектирующие антитела, помеченные металлами (рисунок 3Б). Электроды могут детектировать, например, IL6 при связывании его с антителом в концентрации от 25нг/мл. Также показана чувствительность биосенсеров для IL1B и IL10 в диапазоне 1 до 15нг/мл [147]. В связи с пандемией COVID-19 биосенсеры к таким белкам, как CRP, TNF, IL6, стали наиболее актуальны в связи с тем, что результат анализа на биосенсорах может быть получен за время от нескольких секунд до нескольких минут.

Проточный цитометрический анализ КСБМ на флуоресцентных частицах. Основан на том, что каждая микрочастица помечена разными захватывающими антителами к разным антигенам. Микрочастицы имеют собственную флуоресценцию и различаются по интенсивности этой флуоресценции (чтобы различить, какой антиген будут захватывать антитела, прикрепленные к ней). После помещения этих микрочастиц в плазму крови происходит связывание антигенов (цитокинов) с соответствующим антителом на каждой частице отдельно. Детектирующие антитела помечены другим флуоресцентным маркером (чтобы различить, сколько антител связали антиген на каждой частице, то есть определить количество прилипших к антителам цитокинов). При анализе этих частиц на проточном цитометре и при прохождении микрочастицы через детектор одновременно считывается флуоресцентный маркер самой частицы (код микрочастицы) и количество цитокинов, связанных со специфическими антителами на микрочастице по флуоресценции детектирующих антител [11] (рисунок 3В). Некоторые технологии позволяют увеличить панель флуоресцентного кодирования микрочастиц. Так, технология, зарегистрированная под торговым названием FirePlex, позволяет различать до 70 различных флуоресцентных штрих-кодов на слоеных частицах из гидрогелей, определяя до 70 различный антител, прикрепленных к таким частицам [148]. Используя стратегию сочетания различных уровней интенсивности флуоресценции и различающихся по спектру флуоресцентных маркеров в технологии X MAP Technology (Luminex), удалось добиться различения до 100 частиц, покрытых разными антителами, способных определять до 100 растворенных в плазме белков в одном объеме при использовании многоканальной проточной цитометрии [149].

 

Рисунок 3. Мультиплексные виды анализа КСБМ.

 

В то же время развитие новых методов мечения позволит увеличить одновременно детектирование КСБМ в одном объеме на одной микрочастице или участке микроэрреэя. Для этого в качестве меток могут применяться флуоресцентные маркеры с различным спектром флуоресценции, ионы изотопов металлов или олигонуклеотиды ДНК.

ПРИМЕНЕНИЕ НОВЫХ МЕТОК ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ КСБМ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАСШИРЕНИЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОСТИ

Флуоресцентные метки. В качестве мультиплексных меток чаще всего используют флуоресцентные красители, которые позволяют одновременно различать около 20 антител к 20 различным маркерам на поверхности одной клетки. Более широкий набор меток был разработан относительно недавно. Например, используют синтетические пластики «квантум-дот» с узким спектром излучения. В последние годы приобрел широкую популярность и породил линейку коммерческих продуктов метод, использующий мечение антител изотопами металлов, что позволяет получить более 100 различных меток (рисунок 4).

 

Рисунок 4. Пример использования изотопов и флуоресцентных маркеров в мультиплексном анализе секретируемых интерлейкинов Т-хелперными клетками.

 

Два конъюгированные антитела присоединяются к T-клеточному маркеру на поверхности клетки и одновременно к секретируемому T-клеткой интерлейкину (IL1b или IL17). Таким образом можно измерять для каждой клетки крови специфичный цитокиновый профиль.

Изотопы металлов. Использование изотопов металлов позволило расширить спектр одновременно детектируемых КСБМ. Разработаны устройства, использующие масс-спектрометрический анализ для распознавания (в экспериментальных условиях) концентрации до 100 изотопов металлов, конъюгированных с антителами. Детектирование меченных изотопами антител проводится с использованием метода CyTOF (cytometry by time-of-flight) – «штрих-кодирование живых иммунных клеток цитометрией по времени пролета» [13]. Уже сейчас предлагаются коммерческие продукты, позволяющие одновременно детектировать до 60 КСБМ, находящихся в одном объеме или на одном носителе. В случае использования флуоресцентных магнитных частиц появляется возможность прикрепить на них до 60 первичных антител при анализе на проточном цитометре, совмещенном с масс-спектрометрией. Количество одновременно измеряемых различных белков и метаболитов может достигать1500.

ДНК-метки. Третий интересный метод «штрих-кодирования» антител связан с их мечением уникальными олигонуклеотидными последовательностями ДНК. Этот метод не имеет ограничений по количеству кодирующих последовательностей. Ограничение применения такой метки связано с тем, что возможна деградация ДНК-метки из-за присутствия в физиологических жидкостях гидрализующих ее нуклеаз. Поэтому необходимо применять блокаторы нуклеаз и ограничивать время от начала окрашивания до конечного секвенирования образцов. Метод совместим с NGS-анализом (Next generation sequencing) для определения последовательности ДНК («штрих-кода») и ее количества [150]. Если использовать мечение магнитных частиц с прикрепленными антителами, где детектирующие антитела помечены олигонуклеотидами («штрих-кодами»), то количество одновременно тестируемых белков ограничивается только наличием аффинных антител для пробного сэндвича.

Аптамеры как альтернатива антителам. Ограниченное количество высокоаффинных антител, способных детектировать разнообразие белков и метаболитов, привело к разработке новых подходов. Антитела до сих пор остаются дорогостоящим реагентом в связи с большими затратами на разработку и их получение в больших количествах. Создание аптамеров – олигонуклеотидов ДНК или РНК, способных с высокой аффинностью детектировать КСБМ, привело к удешевлению и расширению возможностей экспресс-анализов [151]. Аптамеры так же, как и антитела, могут быть помечены флуоресцентными метками, изотопами металлов или «штрих-кодированием» (спайкой между уникальными олигонуклеотидными последовательностями ДНК с аптамерами). Селекция новых аптамеров и их использование для вышеперечисленных методов анализа переходит из поисковой научной сферы к промышленным разработкам. В ближайшие десятилетия мы увидим появление новых методов детекции КСБМ с использованием более дешевых реагентов с возможностью мультиплексного тестирования в биологических жидкостях человека.

ФОКУС ОБЗОРА, ОГРАНИЧЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ

Изданная в последние десятилетия литература о роли циркулирующих факторов крови в процессе старения требует систематического осмысления. В результате анализа около 200 источников литературы из баз данных PubMed, Scopus, Web of Science и РИНЦ мы выделили ключевые экспериментальные работы и обзорные статьи, посвященные факторам крови и естественных выделений человека, концентрация которых изменяется в процессе старения, а также ключевым факторам предрасположенности к опасным заболеваниям, связанным с возрастом и/или патологическими состояниями, приводящими к опасным заболеваниям. Среди них есть факторы, вызывающие или отражающие хроническое воспаление, системное накопление сенесцентных клеток, которое участвует в нейродегенеративных расстройствах, указывает на патологии сердечно-сосудистой и выделительной систем, отражающие нарушение метаболизма, снижение общего регенерационного потенциала, а также свидетельствующие о дисфункции иммунной системы. Основным критерием выбора литературы был анализ факторов, связанных с контролем возрастных изменений и старения, а также маркеров – индикаторов подобных процессов.

Фокус нашего обзора был связан с гипотезой, что концентрация и состав белков и метаболитов (КСБМ) может непосредственно отражать патологические процессы, происходящие в организме. Циркулирующие белки и метаболиты доставляют во все части организма управляющие сигналы, непосредственно участвуя в процессах роста, развития и старения. Мы предположили, что именно нарушение этих процессов ведет к патологическим состояниям. И таким образом коррекция на ранней стадии способна замедлить процессы старения до наступления патологических изменений в организме. Тестирование отмеченных нами в обзоре КСБМ позволит выявить системную патологию во всех частях организма, а не только в циркулирующих клетках крови, в отличие от методов, которые сконцентрированы на анализе образцов, взятых непосредственно из проблемных тканей.

Нам представляется возможным создание мультиплексной тестовой системы для клинического анализа, основанной на ограниченном наборе специфических циркулирующих факторов, которые свидетельствуют об отдельном патологическом процессе или серии патологических процессов в организме. Тестовая система может быть использована для постановки диагноза для широкого спектра заболеваний, а также ассоциировать причины заболеваний в единый патологический процесс. При регулярных мониторингах этих факторов возможно отслеживать как предрасположенность к конкретному патологическому процессу на ранних стадиях, так и развитие патологических процессов во времени. Выявление патологических факторов или обнаружение резкого изменения в концентрации определенного белка или метаболита, связанного с патогенезом, может быть поводом для лечебного вмешательства (введение блокирующих антител или инъекции самого действующего белка или ингибитора). Данный подход позволит немедленно скорректировать патологический процесс, а возможно, и предотвратит опасные заболевания на ранних стадиях. Тестирование КСБМ – это относительно простая процедура, которая при наличии устройств или тестеров для экспресс-диагностики позволяет получить результат в течение от нескольких минут до часа после получения образца, а в мультиплексном варианте – проводить одновременное тестирование десятков ключевых факторов для сотен пациентов за ограниченный промежуток времени.

Мы сознательно ограничили обсуждение обширных исследований и методов тестирования старения и биологического возраста по анализу ДНК-модификаций, так как нашей целью было выявить методы, которые могут быть проведены сравнительно простым и дешевым способом, и дать непосредственные рекомендации о возможной коррекции патологических состояний. Обсуждаемые нами методы позволяют произвести анализ при отборе относительно небольшого образца периферической крови, где исследуемый фактор находится в относительно низкой концентрации. Такие анализы могут быть произведены как в рамках ординарных клинических лабораторий, так и индивидуально на дому. В высокотехнологических центрах медицинского анализа такие методы позволяют производить анализ массово и с небольшими финансовыми затратами.

Анализ модификаций генома/гистонов требует дорогостоящих и затратных по времени методов, а также достаточно большого количества клеточного материала для исследований. Именно поэтому эти методы анализа модификаций генома остаются передовой и прорывной частью науки, но для массового применения в качестве рутинных тестов в клинике, а тем более для индивидуального использования требуются дополнительные исследования и шаги для их адаптации. В то же время маркеры, которые мы предлагаем для обсуждения, отражают системный уровень патологий, но требуют дальнейших клинических испытаний и статистической оценки на более широкой группе пациентов с различными заболеваниями, связанными с возрастом, и оценки их связи со случаями ускоренного старения. Мы также допускаем, что конкретные рыночные условия, убежденность населения и требования институтов, принимающих финансовые решения, могут существенно влиять на внедрение подобных методов тестирования, а также на коммерческий успех и широкое применение.

ВЫВОДЫ

Старение организма сопровождается увеличением его биологического возраста, который в норме должен коррелировать по времени с календарным возрастом. Однако некоторые внутренние эпигенетические модификации, патологические условия и влияние окружающей среды могут замедлить или ускорить процесс естественного старения.

Блокирование факторов, отрицательно влияющих на продолжительность жизни и/или их лечение, которое позитивно сказывается на здоровье и долголетии, является разумной стратегией предотвращения ускоренного старения, предупреждения развития старческих заболеваний, ранней инвалидности и продления активной жизни пожилых людей [73, 133]. Среди стратегий, уже апробированных в клинической практике или которые будут переведены в клиническую практику, можно выделить следующие: преодоление инсулинорезистентности второго типа путем изменения диеты [100]; фармакологическое лечение инсулинорезистентности; стимуляцию восстановления тканей с помощью окситоцина, гормона роста в сочетании с препаратами, повышающими чувствительность к инсулину; предотвращение развития хронического воспаления путем своевременного лечения, вакцинации и использования антивоспалительных лекарств; внедрение сенолитических препаратов и других герантопротекторов [96]. Все эти меры невозможны без внедрения дешевых массовых методов мониторинга объективных показателей старения по показателям крови, слюны и других физиологических жидкостей.

Будущее медицины за созданием «гигиены старения» – мультиплексного анализа КСБМ, позволяющего проводить периодический регулярный мониторинг изменений состава ключевых факторов в домашних условиях с комплексной автоматической оценкой программными средствами и выдачей оценки и программы реабилитации в случае отклонения от нормы.

Рассмотренные выше факторы и индикаторы, отражающие естественные и патологические процессы старения, могут быть использованы для создания панели мониторинга старения. Циркулирующие факторы могут не только отражать старение организма, быть предикторами развития опасных заболеваний, но и служить потенциальными лекарственными препаратами для коррекции старения и патологических состояний.

В обзоре мы предложили комплексный мониторинг показателей и маркеров биологического возраста, показывающих функциональные изменения в стареющем организме, в целях разработки перспектив защиты здоровья, задержки старения, нахождения новых подходов к омоложению для пожилых людей и поддержки здорового старения и продления активной жизни.

Конфликт интересов: все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского Научного Фонда №19-18-00058.

Благодарности. Авторы выражают благодарность Анне Едовиной и Валерии Кащенко за помощь в подготовке иллюстраций к обзору. Авторы выражают свою искреннюю благодарность одному из основных авторов этого обзора Александру Каганскому за его неоценимый вклад в идею и написание статьи и скорбят о его безвременной и трагической кончине.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота; РНК – рибонуклеиновая кислота; КСБМ – концентрация и состав белков и/или метаболитов;ВД – возрастная динамика; СОД – супероксиддисмутаза;

ИФА – иммуноферментный анализ; ПЦР – полимеразная цепная реакция; ИХА – иммунохроматографический анализ; СКФ – скорость клубочковой фильтрации.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

About the authors

Nikita D. Kurgan

ITMO University

Email: mika97@list.ru

research engineer Faculty of Technological Managementand Innovations

Russian Federation, St. Petersburg

Evgeniya I. Panova

ITMO University

Email: evgeniyapanova1996@gmail.com

research engineer Faculty of Technological Management and Innovations

Russian Federation, St. Petersburg

Lyubov V. Silakova

ITMO University

Email: silakovalv@itmo.ru
ORCID iD: 0000-0003-2836-1281

PhD in Economics, Associate professor Faculty of Technological Management and Innovations

Russian Federation, St. Petersburg

Aleksandr M. Kaganskii

ITMO University; Far Eastern Federal University

Email: kagasha@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0002-6219-6892

PhD in Biology, Associate professor, Faculty of Technological Management and Innovations; Director of the Center for genomic and regenerative medicine, School of Biomedicine

Russian Federation, St. Petersburg; Vladivostok

Stanislav A. Rybtsov

Center for Regenerative Medicine, Institute of Regeneration and Reparation,
University of Edinburgh

Author for correspondence.
Email: srybtsov@ed.ac.uk
ORCID iD: 0000-0001-7786-1878

PhD in Genetics, senior research fellow of the Centre for Regenerative Medicine, Institute of Regeneration and Repairation

United Kingdom, Edinburgh

References

Supplementary files