Том 57, № 4 (2023)

Эндотелиальные клетки, выстилающие внутреннюю стенку кровеносных сосудов, контактируют с кровью и растворенными в ней веществами, подвергаются механическим воздействиям и демонстрируют заметную неоднородность в своей реакции на экзогенные и эндогенные стимулы. Эндотелиальные клетки обладают уникальными свойствами, которые зависят от их расположения, определяются сосудистыми нишами и играют важную роль в регуляции гомеостаза сосудистой системы. Динамическое фенотипическое переключение эндотелиальной гетерогенности может привести к дисфункции эндотелиальных клеток и сыграть существенную роль в патогенезе множества заболеваний. В настоящее время пристальное внимание привлекает эндотелиально-мезенхимальный переход (endothelial-mesenchymal transition, EndMT) ‒ процесс, при котором эндотелиоциты приобретают новые свойства, экспрессируют маркеры мезенхимальных клеток, такие как альфа-актин гладких мышц и виментин, что приводит к изменению их морфологии и появлению способности к миграции. EndMT может индуцироваться различными стимулами или патологическими состояниями, включая воспаление, гипоксию, окислительный стресс. EndMT играет важную роль в патогенезе ряда заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых. В представленном обзоре рассмотрены маркеры, индукторы и ингибиторы EndMT, методы изучения in vitro и in vivo EndMT, а также роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний.

5-Метил-2'-дезоксицитидин (mC) в составе СpG-сайтов играет ключевую роль в эпигенетической регуляции работы генов, механизмах дифференцировки клеток и канцерогенезе. Несмотря на важность mС для нормального функционирования клетки, CpG-динуклеотиды являются горячими точками мутагенеза. mC дезаминируется с образованием Т, вызывая транзиции C→T. Однако в последние годы появляются отдельные исследования о влиянии эпигенетических модификаций С на точность и эффективность работы ДНК-полимераз и ферментов эксцизионной репарации. В настоящем обзоре обобщены данные, указывающие на существование независимых от дезаминирования механизмов мутагенеза в CpG-сайтах.

Анализ древней ДНК позволяет решать научные проблемы, связанные с геногеографическим происхождением и моделями миграции популяций. Хазарский каганат является предметом спора ученых: его сложное историческое становление, отсутствие достаточного количества художественных и письменных источников, а также исчезновение представителей хазарской культуры оставляет открытым вопрос о внешнем облике хазар. Нами проведено ДНК-фенотипирование костных останков из элитных погребений Юга России хазарского времени по признакам цвета глаз, волос, кожи, групп крови по системе АВ0. Установлено, что 8 из 10 погребенных имели при жизни карие глаза, темные волосы, а также преимущественно смуглую кожу. Люди из двух погребений имели серо-голубые глаза, а один человек – светлые волосы. У восьми индивидов установлена наиболее вероятная группа крови по системе AB0: пятеро имели группу 0 (I), четыре – A (II), один – B (III). Оценка распределения аллелей 10 аутосомных маркеров, обладающих популяционной специфичностью, свидетельствует о высокой гетерогенности этногеографического происхождения исследованных хазар. Полученные результаты свидетельствуют об этнокультурном, генетическом и фенотипическом разнообразии Хазарского каганата.

Избыточное поглощение богатых холестерином липопротеинов низкой плотности макрофагами сосудистой стенки приводит к трансформации макрофагов в пенистые клетки, накоплению липидов в интиме артерий и, как следствие, к образованию атеросклеротических бляшек и развитию сердечно-сосудистых заболеваний. Адипонектин – секретируемый жировой тканью адипокин, вызывает антиатерогенные и противовоспалительные эффекты, взаимодействуя с рецепторами AdipoR1 и AdipoR2. Одним из механизмов антиатерогенного действия адипонектина может быть участие в регуляции обратного транспорта холестерина и предотвращение образования пенистых клеток. Мы предположили, что низкомолекулярный агонист рецепторов адипонектина – адипорон – может модулировать экспрессию генов обратного транспорта холестерина и воспаления в макрофагах человека, и изучили влияние различных концентраций адипорона (0, 5, 10 и 20 мкМ) на экспрессию генов ABCA1, ABCG1, APOA1, NR1H3 (LXRα), NR1H2 (LXRβ), PPARG, ACAT1, IL6, TNFA, TLR4 в клетках первичной культуры макрофагов человека, а также на макрофаги линии THP-1. Выживаемость клеток оценивали с использованием MTS-теста. Уровень мРНК генов ABCA1, ABCG1, APOA1, NR1H3, NR1H2, PPARG, ACAT1, IL6, TNFA, TLR4 в первичной культуре макрофагов человека оценивали методом ПЦР в реальном времени. Показано увеличение относительного уровня мРНК генов PPARG и ABCA1 при воздействии адипорона в концентрации 5 и 10 мкМ в течение суток. Отмечен цитотоксический эффект адипорона в высокой концентрации (20 мкМ), выраженный в большей степени в макрофагах линии THP-1. Полученные данные о влиянии адипорона на макрофаги человека и изучение возможных агонистов рецепторов адипонектина представляют значительный интерес, учитывая необходимость поиска новых подходов к профилактике и лечению атеросклероза.

Статус метилирования ДНК в геноме человека изменяется в патогенезе распространенных заболеваний и выступает в качестве предиктора ожидаемой продолжительности жизни. В связи с этим представляет интерес исследование уровня метилирования регуляторных регионов генов, отвечающих за общебиологические процессы, потенциально значимые для развития возраст-ассоциированных заболеваний. Среди них гены белков различных систем репарации ДНК, продукты которых характеризуются плейотропными эффектами. В исследовании представлены результаты таргетного анализа метилирования двух регионов генома (промоторного участка гена MLH1 и энхансерного ‒ вблизи гена ATM) в разных тканях пациентов с атеросклерозом сонных артерий. В результате анализа профилей метилирования исследованных генов в различных тканях одних и тех же индивидов выявлено наличие выраженных различий между лейкоцитами и тканями сосудистой стенки. Различия по уровням метилирования в нормальных и пораженных атеросклерозом тканям сонных артерий обнаружены только для двух исследованных CpG-сайтов в гене ATM (chr11:108089866 и chr11:108090020, сборка GRCh37/hg19). На основании этих данных можно предполагать участие ATM в развитии атеросклероза. “Нагруженность” изученных регионов сайтами связывания транскрипционных факторов (по данным ReMapp2022) свидетельствует о том, что тканеспецифичный характер метилирования регуляторных участков генов MLH1 и ATM может быть связан с уровнем их экспрессии в конкретной ткани. Показано, что межиндивидуальные различия в уровнях метилирования CpG-сайтов ассоциированы с достаточно удаленными нуклеотидными заменами.

Полностью транс-ретиноевая кислота, применяемая в терапии острого промиелоцитарного лейкоза, известна как часто используемый для индукции дифференцировки препарат, который восстанавливает экспрессию ключевого фактора транскрипции PU.1, детерминирующего нормальный гемопоэз клеток миелоидной линии. Ранее мы обнаружили, что индуцируемая стрессом гистондеметилаза H3K27 – JMJD3 – прямо активирует экспрессию PU.1, что стимулирует коммитирование миелоидных клеток в ходе нормального миелопоэза. Кроме того, JMJD3 действует как онкорепрессор и играет критически важную регуляторную роль в инициации и прогрессии злокачественного гемопоэза. В настоящей работе продолжено изучение связи между JMJD3 и PU.1 при остром промиелоцитарном лейкозе, при котором JMJD3 проявляет онкосупрессорную активность, стимулируя экспрессию PU.1.

Малые некодирующие РНК (микроРНК) регулируют экспрессию генов, стабилизируют клеточный фенотип и играют важную роль в дифференцировке, развитии и апоптозе клеток. Канонический путь биогенеза микроРНК включает несколько этапов посттранскрипционного процессинга и транспорта и завершается цитоплазматическим расщеплением пре-микроРНК рибонуклеазой типа III DICER с формированием зрелого дуплекса, который встраивается в комплекс RISC. Биогенез микроРНК и их роль в таком важном процессе, как клеточный стресс, изучены недостаточно. В данной работе с использованием проточной цитофлуориметрии и высокопроизводительного анализа экспрессии генов показано, что хронический стресс эндоплазматического ретикулума (ЭПР) – один из видов клеточного стресса, связанного с нарушением сворачивания белков в ЭПР – приводит к формированию фенотипа клеточного старения в фибробластоподобных клетках FRSN. Острый стресс ЭПР способен снижать биогенез микроРНК, тогда как хронический стресс не вызывает существенного падения глобальной экспрессии микроРНК и сопровождается лишь незначительным снижением экспрессии мРНК DICER1. Обнаружено также увеличение гетерогенности клеточной популяции по активности лизосомной бета-галактозидазы при хроническом стрессе ЭПР. Не исключена индуцируемая или исходная неоднородность клеточной популяции и по экспрессии компонентов пути биогенеза микроРНК.

Малые GTPaзы Ras функционируют как молекулярные переключатели, регулирующие клеточный гомеостаз. Ras-зависимые сигнальные пути регулируют такие важные процессы, как прохождение клеточного цикла, апоптоз, миграция и старение клеток. Нарушение сигнального пути Ras связано с несколькими патологическими состояниями. Установлено, что белки Ras могут участвовать в регуляции окислительно-восстановительных сигнальных путей, включая влияние на уровень активных форм кислорода, создающих условия для канцерогенеза. Предполагается, что активные формы кислорода и разобщение митохондриальных функций являются главными факторами, воздействующими на физиологические процессы в клетках и вовлеченными в разные патологии. В настоящей работе изучена роль Ras1, трет-бутилгидропероксида (tBHP) и антимицина A в ответе клеток Schizosaccharomyces pombe на окислительный стресc. Обнаружено снижение выживаемости, более высокий уровень активных форм кислорода и нарушение функций митохондрий в клетках ras1Δ и в клетках дикого типа, обработанных tBHP, а также ингибитором дыхательной цепи антимицином А. Более того, эти эффекты сильнее выражены в обработанных антимицином или tBHP клетках ras1Δ. Показано также, что Ras1 регулирует экспрессию и активность таких антиоксидантных ферментов, как глутатионпероксидаза (GSH-Px), глутатион-S-трансфераза (GST) и каталаза. Эти результаты свидетельствуют о потенциальной роли Ras1 S. pombe в смягчении ответа на окислительный стресс.

Гепатоклеточная карцинома (HCC) – наиболее часто диагностируемый первичный рак печени. В прогрессии опухолей могут участвовать опухолеассоциированные макрофаги, фенотипически сходные с макрофагами М2, которые секретируют цитокины, супрессирующие иммунный ответ опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов. Изучена роль макрофагов М2 в прогрессии НСС и влияние ингибитора рецептора 2 фактора роста сосудистого эндотелия – апатиниба. В качестве модели НСС использовали клеточную линию Hepb3. Макрофаги M2 получены путем дифференцировки клеток THP-1. Для кокультивирования макрофагов М2 и клеток Hepb3 использовали ячейку Transwell. Жизнеспособность и пролиферативную способность клеток определяли методами CCK-8 и EdU. Метастатический потенциал клеток оценивали, используя метод определения миграции Transwell. Уровни экспрессии цитокинов определяли с помощью иммуноферментного анализа. Активацию оси VEGFR2/STAT3/PD-L1 количественно оценивали с помощью вестерн-блотинга. Показано, что cокультивирование с макрофагами М2 способствовало пролиферации, повышению жизнеспособности, продукции цитокинов, инвазии и миграции клеток Hepb3. При кокультивировании значительно увеличивалась секреция TGF-β1, IL-6, MMP-9 и VEGF. Aпатиниб супрессировал индуцируемую макрофагами M2 пролиферацию, жизнеспособность клеток Hepb3, их инвазию и миграцию. Более того, апатиниб заметно снижал уровни экспрессии p-VEGFR2, p-STAT3 и PD-L1 в клетках Hepb3 в условиях кокультивирования. Таким образом, апатиниб может супрессировать опосредуемое опухолеассоциированными макрофагами поведение клеток HCC посредством модуляции сигнального пути VEGFR2/STAT3/PD-L1.

Инфекция Helicobacter pylori (H. pylori) иногда вызывает стойкий воспалительный ответ в эпителиальных клетках слизистой оболочки желудка человека, что может приводить к возникновению рака. Однако основной механизм канцерогенеза пока не выяснен. Нами разработаны модели хронической инфекции H. pylori в клетках GES-1 и на мышах C57BL/6J. Для определения уровня интерлейкина-8 (IL-8) использовали иммуноверментный анализ. Экспрессию мРНК и белков NF-κB p65, IL-8, Wnt2 и β-катенина определяли методами ПЦР в режиме реального времени, иммуноблотинга, иммунофлуоресцентного окрашивания и иммуногистохимии. Инфекцию H. pylori у мышей оценивали с помощью экспресс-теста на уреазу, окрашивания гематоксилином‒эозином и серебрения по Вартину–Старри. Исследование морфологических изменений в слизистой оболочке желудка проводили методом электронной микроскопии. Выявлено, что в клетках слизистой оболочки желудка, инфицированных H. pylori, наряду с активацией сигнального пути NF-κB и повышением концентрации IL-8, значимо повышалась экспрессия Wnt2. На основании этих результатов можно предполагать, что IL-8 позитивно регулирует экспрессию гена Wnt2. При исследовании хронической инфекции H. pylori на модели мышей C57BL/6J показано, что у экспериментальных животных повышена частота предраковых поражений в ткани слизистой оболочки желудка. При сравнении ультраструктурных изменений в клетках слизистой оболочки желудка и анализе взаимосвязи между сигнальным путем NF-κB и экспрессией Wnt2 обнаружено, что инфекция H. pylori активирует сигнальные пути NF-κB, а массивное высвобождение IL-8 положительно коррелирует с высокой экспрессией белка Wnt2. Как следствие, активация сигнального пути Wnt/β-catenin может быть вовлечена в злокачественную трансформацию клеток слизистой оболочки желудка. Таким образом, хроническая инфекция H. pylori может приводить к персистентному воспалительному ответу: активировать путь NF-κB, способствовать высвобождению IL-8 и тем самым активировать путь Wnt/β-catenin. IL-8, по-видимому, играет роль линкера в сцеплении этих двух сигнальных путей.

Реакции ферментативного метилирования, катализируемые метилтрансферазами, играют важнейшую роль в метаболизме клеток. Основным донором метильных групп в этих реакциях служит S-аденозил-L-метионин. Акцепторами метильных групп могут быть нуклеиновые кислоты, белки, а также различные низкомолекулярные соединения. У млекопитающих метилирование остатков цитозина по положению С5 в CpG-последовательностях ДНК осуществляется de novo ДНК-метилтрансферазой Dnmt3a, а “рисунок метилирования” относится к факторам, определяющим эпигенетическую регуляцию экспрессии генов. В настоящей работе впервые исследовано взаимодействие фосфонистых и фосфоновых аналогов S-аденозил-L-метионина и S-аденозил-L-гомоцистеина, в которых карбоксильная группа заменена на соответствующий фосфорсодержащий фрагмент, с каталитическим доменом Dnmt3a. В реакции метилирования ДНК, катализируемой Dnmt3a, эти аналоги S-аденозил-L-метионина оказались лишь в 2 раза менее эффективными донорами метильной группы, чем природный S-аденозил-L-метионин. Оба фосфорсодержащих аналога S-аденозил-L-гомоцистеина, природного ингибитора метилтрансфераз, проявляли близкую ингибиторную активность в отношении Dnmt3a и были примерно в 4 раза менее активными, чем S-аденозил-L-гомоцистеин. Весьма неожиданной оказалась сопоставимость величин активностей фосфонистых и фосфоновых аналогов S-аденозил-L-метионина и S-аденозил-L-гомоцистеина, поскольку геометрия и заряд фосфорсодержащих фрагментов существенно различаются. Обсуждаются возможности использования фосфоаналогов S-аденозил-L-метионина и S-аденозил-L-гомоцистеина в качестве инструментов исследования метилтрансфераз.

Гребневик (Ctenophora) Mnemiopsis leidyi A. Agassiz, 1865 отвечает на слабое механическое раздражение интенсивной люминесценцией, однако механизм этого явления не известен. Нами проведен поиск возможных тактильных рецепторов, которые инициируют сигнальную трансдукцию, заканчивающуюся люминесценцией фотобелков. В геноме M. leidyi найдены три гена ортолога TRPC-белков мыши (5z96) и дрозофилы (5vkq) – ML234550a-PA (860 аа), ML03701a-PA (828 аа) и ML038011a-PA (1395 аа). Последний белок содержит длинную анкириновую спираль, состоящую из 16 ANK-доменов. Изучение аннотированных доменов и сети взаимодействий между белками интерактома позволяет предположить, что белки ML234550a-PA и ML03701a-PA осуществляют цитоплазматическую, а ML038011a-PA – внутриядерную трансдукцию механических сигналов. Пространственная реконструкция выявила различия в структуре этих белков, что может быть связано с их разными функциями в клетке. Обсуждается, какой из этих белков участвует в инициации люминесценции после механического раздражения.