Newly formated (tertiary) lymphoid structures in tumor growth

Full Text

ВЛО – вторичный лимфоидный орган; ТЛС – третичная лимфоидная структура; ТЛУ – третичный лимфоузел; ЛУ – лимфатический узел; ВЛУ – вторичный лимфатический узел.

ВВЕДЕНИЕ

Опухоли возникают и развиваются в сложном и динамичном микроокружении, и существуют эндотелиальные клетки, иммунные клетки и стромальные клетки, находящиеся вокруг или внутри микроокружения опухоли и взаимодействующие с опухолевыми клетками [1, 2]. Результаты исследований показали, что регуляция противоопухолевой защиты происходит не только во вторичных лимфоидных органах (ВЛО), но также и непосредственно рядом с опухолью в составе организованных клеточных агрегатов, напоминающих ВЛО, получивших название «третичные лимфоидные структуры» (ТЛС) [3, 4, 5].

ВЛО, как правило, закладываются внутриутробно, однако имеются данные, что образование новых лимфоидных тканей может повторно реализоваться в постнатальном периоде при неолимфогенезе.

Значительное количество работ описывает новообразование лимфоидных структур при хронических инфекциях [6], при опухолевой патологии [4], а также в воспаленных тканях как часть определенного патологического процесса – онкологического заболевания, аутоиммунных заболеваний [7] или отторжения аллотрансплантата [8] из-за длительной хронической стимуляции лимфоидной системы. В частности, ТЛС обнаруживаются в опухолях, где они генерируют локальные и системные противоопухолевые реакции [9]. ТЛС являются ключевым элементом иммунного микроокружения опухоли, которое состоит из T-клеток, B-клеток, различных клеток системы мононуклеарных фагоцитов, включая фолликулярные дендритные клетки и венулы с высоким эндотелием [10, 11].

Исследователи показали, что наличие ТЛС в микроокружении опухоли улучшает эффект иммунотерапии и выживаемость пациентов при меланоме и саркоме [12, 13]. Имеются данные, что при длительных хронических воспалительных процессах, после аллотрансплантации, при болезнях аутоиммунной природы и при злокачественных новообразованиях обнаруживаются ТЛС. На сегодняшний день есть доказательства того, что образование третичных лимфоидных структур – это результат совокупного взаимодействия множества клеточных популяций, включая лимфоциты и клетки системы мононуклеарных фагоцитов, их взаимодействия со стромальными структурами и клетками с участием молекул адгезии, цитокинов и хемокинов.

Имеющиеся публикации не дают представления о четкой структурной организации ТЛС, большинство работ посвящено изучению подобных структур у человека, при этом практически нет работ, отражающих результаты исследования на лабораторных животных.

ЦЕЛЬ

Воспроизвести ТЛС и изучить их особенности при злокачественном новообразовании в эксперименте.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на кафедре онкологии с курсами онкологии и патологической анатомии ИДПО Башкирского государственного медицинского университета. Часть лабораторных исследований проводилась в лаборатории Всероссийского центра глазной и пластической хирургии Минздрава России. Иммуногистохимические исследования осуществлялись в лабораториях резидентов инновационного центра «Сколково». Для экспериментов использовали белых крыс – самцов, альбиносов стрессоустойчивой линии вистар из питомника «Рапполово», вес животных варьировал в пределах 120–180 г, возраст 6–8 недель.

Для экспериментального моделирования опухолевого роста был взят штамм крысиной саркомы М1. Данный опухолевый штамм относится к числу быстрорастущих, агрессивных опухолей с достаточно коротким инкубационным периодом, отличается большой биомассой и высокой степенью перевиваемости (98–100%). Динамику роста опухоли оценивали путем вычисления объема опухоли. Объем определяли общепринятым методом, рассчитывая его по формуле Шрека для эллипсоидов – a⋅b⋅c⋅π/6 см³, где a, b и c – максимальные диаметры опухолевого узла (в см) в трех взаимно перпендикулярных плоскостях.

На первом этапе эксперимента пятнадцати крысам одномоментно была проведена перевивка опухолевого штамма саркома М1 по описанной методике. Далее на протяжении 16 дней проводили оценку динамики роста опухоли.

Объектом исследования являлись третичные лимфоузлы (ТЛУ), индуцированные опухолевым ростом перевивной саркомы М1. Для сравнительного анализа был произведен забор лимфоузлов без метастатического поражения (вторичных) и метастатических лимфоузлов с метастазами саркомы М1.

На 16-е сутки животных выводили из эксперимента путем внутрибрюшинного введения ксилазина гидрохлорида 2% в летальной дозе 1 мл.

В последующем три группы лимфоузлов были исследованы макро- и микроморфометрическим, гистологичесим и иммуногистохимическим методами.

Зону подмышечных лимфатических узлов обрабатывали ультразвуковым сонлиподеструктором. Выделение лимфатических узлов и сосудов из тканей подмышечной области производилось с помощью ультразвукового аппарата LySonix 3000® с PulseSelect ™ методом, разработанным профессором Ш.Х. Ганцевым (патент №2333776 от 20.09.2008).

После обработки выделенные лимфоузлы измеряли по взаимно перпендикулярным осям X – длина, Y – ширина, Z – высота. Расположение лимфатического узла – параллельно оси X в наибольшем измерении.

Лимфатические узлы (ЛУ) фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина, обрабатывали по стандартной гистологической методике и заливали в парафин. Толщина гистологических срезов 1–3 мкм.

Микроморфометрически исследовали основные структурно-функциональные зоны ЛУ: количество лимфоидных фолликулов в десяти произвольно выбранных полях зрения при увеличении микроскопа 200; среднюю суммарную площадь кровеносных сосудов (мкм²) в двадцати произвольно выбранных полях зрения при увеличении микроскопа 400; ширину промежуточного синуса и краевого синусов (мкм) в двадцати произвольно выбранных полях зрения при увеличении микроскопа 400.

Исследованию подвергались готовые оцифрованные изображения иммуногистохимической экспрессии фиксированной панели антител CD3 (Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы/индукторы), CD20 (В-лимфоциты), CD30 (активированные лимфоциты), CD68 (все макрофаги).

Для анализа результатов иммуногистохимической экспрессии проводили подсчет положительно окрашенных клеток на 2000 клеток в десяти случайным образом отобранных полях зрения (при увеличении х 40). Учитывали умеренное и выраженное иммуногистохимическое окрашивание. Сравнительное исследование проводили в следующих группах: (1) метастатические лимфоузлы с метастазами саркомы М1, (2) вторичные лимфоузлы (без метастатического поражения), (3) третичные лимфоузлы (без метастатического поражения).

Положительно окрашенные клетки считали по основным структурно-функциональным зонам лимфоузлов, по каждому маркеру в отдельности: кортикальный синус, промежуточный синус, паракортикальная зона, лимфоидные фолликулы.

В работе использовались антитела, согласно протоколу компании-изготовителя Leica, подходящие для исследования на крысах. Все реакции были проведены при наличии позитивного контроля.

Статистический анализ данных проводили с помощью тестовых версий интегрированного пакета Statistica for Windows, опубликованных в интернете в свободном доступе. Предварительный анализ выборок и групп состоял в оценках выскакивающих значений по тесту Граббса и тестов на нормальность распределения по Колмогорову – Смирнову и Шапиро – Уилку. Также был использован тест Фишера на равенство дисперсий. Рассчитывали следующие статистические характеристики переменных: среднюю арифметическую, стандартное отклонение, ошибку средней, медиану, нижний и верхний квартили.

В зависимости от характера распределения переменных использовали как параметрические, так и непараметрические методы статистической обработки. Для переменных, соответствующих критериям нормального распределения, применяли параметрические методы, в частности, однофакторный дисперсионный анализ с расчетом критерия Фишера и множественное сравнение средних с помощью теста Тьюки. В отдельных случаях после параметрических расчетов анализ проверялся ранговыми методами для исключения возможных ошибок. В случае отсутствия условий для использования параметрических тестов применяли непараметрический (ранговый) дисперсионный анализ Краскела – Уоллиса с расчетом критерия Н и его статистической значимости (р). Для множественного сравнения средних рангов применяли метод Данна. Критический уровень статистической значимости при сравнении характеристик групп принимался за 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

После перевивки опухоль характеризовалась активным ростом, появление пальпируемого опухолевого узелка у животных наблюдали на четвертый день после введения опухолевого субстрата. К шестнадцатому дню эксперимента (срок плановой эвтаназии) объем опухоли достигал 2 см³

Гистологическое описание саркомы М1: опухоль имеет солидно-гнездное строение с умеренным клеточным полиморфизмом, со смещением ядерно-цитоплазматического отношения в сторону ядра; с ярко выраженным полиморфизмом ядер с грубыми и хорошо заметными ядрышками; с многочисленными фигурами митозов, в том числе патологическими.

При детальном исследовании опухоли саркомы М1 были выявлены ее отличия от саркомы, которую описывали ученые в 1947 году. Как показали экспериментаторы Л.М. Шабад и М.М. Блох, впервые описавшие новый перевиваемый штамм саркомы крыс М1 в 1947 году, опухоль состояла из разнообразных по форме и величине соединительнотканных клеток, переплетающихся в разных направлениях. Размеры и форма ядер клеток варьировали в зависимости от размера и формы опухолевых клеток. Ядра крупные, расположены эксцентрично, хроматин в них собран в виде крупных гиперхромных скоплений, которые подчас маскировали ядрышки. Цитоплазма опухолевых клеток отличалась значительной базофилией. Для более детального изучения полученного образца саркомы М1 и оценки потенциала метастазирования мы использовали маркер E-cadgerin, который показал фоновое цитоплазматическое окрашивание, что указывало на слабые межклеточные контакты и потенциально высокий риск метастазирования. Также проведена окраска опухоли на наличие виментина, являющегося структурным протеином промежуточных филаментов соединительных тканей, высокая концентрация которого была обнаружена. Таким образом, интенсивная цитоплазматическая экспрессия виментина в опухоли показывает повышенную способность к метастазированию и является показателем особой злокачественности.

Макроморфометрическая характеристика вторичных, метастатических и ТЛУ: подмышечные ЛУ животных в большинстве своем имели бобовидную и овоидную форму, также присутствовали ЛУ округлой формы меньшего и большего диаметра. Количество подмышечных ЛУ варьировало от 3 до 5 в зависимости от наличия или отсутствия процессов метастазирования и неолимфогенеза.

Вторичные лимфатические узлы (ВЛУ) без очагов метастазирования имели бобовидную форму, несколько приносящих (афферентных) лимфатических сосудов и один выносящий (эфферентный) сосуд. Количество приносящих в лимфатический узел афферентных лимфатических сосудов превышало количество эфферентных лимфатических сосудов в соотношении 3:1, 4:1 и 5:1, что и является общепризнанной нормой.

После тщательной сонолиподеструкции подмышечных зон лабораторных животных были четко выделены лимфатические узлы. В наибольшем измерении размер метастатических узлов был 8,4±1,3 мм, вторичных – 5,6±0,2 мм, третичных – 2±0,6 мм. Предварительное введение красителя до некропсии позволило зафиксировать лимфатический блок. Так, при частичном или полном «метастатическом блоке» лимфатического узла наблюдалось распространение красителя в обход блокированного узла, по коллатеральным лимфатическим сосудам. Особенностью новообразованных коллатеральных сосудов было наличие на них округлых или овальных лимфоидных образований диаметром до 2,5 мм. У 9 из 15 лабораторных животных в правой подмышечной области кроме обычных ЛУ, описанных в нормальной анатомии крыс, со стороны опухоли были обнаружены ТЛУ, они располагались вблизи гистологически верифицированного метастатического лимфатического узла (МЛУ).

ТЛУ имели достоверно меньшие размеры (рисунок 1) в сравнении с ЛУ, которые были расценены как неизмененные (вторичные, нативные). ТЛУ, как правило, имели округлую форму, как и МЛУ, в отличие от ВЛУ, соответствующих бобовидной форме.

 

Рисунок 1. Данные исследования, третичный лимфоузел: 1 – макроскопическое строение, масштабный маркер – 3 мм; 2 – гистологическое строение, окраска гематоксилином и эозином, ×50. / Figure 1. Study data, tertiary lymph node: 1 – macroscopic structure, scale marker – 3 mm; 2 – histological structure, staining with hematoxylin and eosin, ×50.

 

Измеряли линейные размеры ЛУ в трех взаимно перпендикулярных измерениях по осям X – длина, Y – ширина, Z – высота. Ориентация узла – параллельно оси X в наибольшем измерении. Статистическая обработка полученного материала показала статистически значимые различия по всем линейным измерениям. Сравнительная морфологическая характеристика ВЛУ, МЛУ и ТЛУ лабораторных животных выполнялась по результатам анализа гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином.

Таким образом, сравнительные микроморфометрические исследования и статистический анализ полученных данных выявили, что группа ТЛУ имеет особенности строения по всем исследованным параметрам: ширине краевого и промежуточного синусов, количеству лимфоидных фолликулов и средней суммарной площади кровеносных сосудов. В частности, у ТЛУ расширены краевые синусы (как и у МЛУ); меньшее число лимфоидных фолликулов; средняя суммарная площадь кровеносных сосудов выше на 92% по сравнению с МЛУ и на 78% по сравнению с ВЛУ.

Учитывая полученные результаты, можно сделать вывод о том, что ТЛУ имели все необходимые структурные составляющие лимфатических узлов с определенными особенностями, что, в свою очередь, позволяет предположить отличный функциональный статус ТЛУ от ВЛУ и МЛУ.

Результаты иммуногистохимических исследований также выявили различия в исследуемых группах лимфатических узлов. Наиболее значимые различия показателей экспрессии изученных маркеров были выявлены в кортикальном синусе лимфатических узлов, где 4 из 5 маркеров показали наивысшее число положительно окрашенных клеток с такими маркерами, как CD3, CD4, CD20, CD30 (рисунок 2).

 

Рисунок 2. Показатели экспрессии CD3, CD4, CD20, CD30, CD68 в кортикальном синусе вторичных, метастатических и третичных лимфатических узлов. / Figure 2. Expression indices of CD3, CD4, CD20, CD30, CD68 in the cortical sinus of secondary, metastatic and tertiary lymph nodes.

 

Разработанная методика выделения и визуализации ТЛУ на модели перевиваемой саркомы М1 крысам с последующим проведением иммуногистохимического исследования позволила выявить ряд специфических признаков ТЛУ. Увеличение количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD3, в паракортикальных зонах (p=0,0309), что в полтора раза больше, чем в МЛУ, и максимальное по сравнению с МЛУ и ВЛУ количество СD3+ клеток в промежуточных синусах ТЛУ. Содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD4, в паракортикальных зонах ТЛУ в 1,2 раза больше, чем в ВЛУ (p=0,0168), и в 3,1 раза больше, чем в МЛУ (p=0,0000). Число Т-хелперов, экспрессирующих CD4, в краевых (в 2,0 (p=0,0000) и в 1,1 (p=0,038409) раза больше соответственно) и промежуточных (в 1,1 раза (p=0,000063, p=0,0022)) синусах ТЛУ максимальное по сравнению с ВЛУ и МЛУ. Содержание СD20+ клеток в промежуточных синусах и паракортикальных зонах минимальное по сравнению с ВЛУ и МЛУ – не более чем в два раза, и В-лимфоцитов в лимфоидных фолликулах ТЛУ больше в 2,0 раза по сравнению с МЛУ (p=0,0332) и в 3,8 раза по сравнению с ВЛУ (p=0,0000).

Максимальное по сравнению с НЛУ (p=0,0063) и МЛУ (p=0,0008) увеличение количества СD30+ клеток в краевых – в 16,0 раза и промежуточных синусах ТЛУ соответственно в 2,4 (p=0,0118) и в 3,2 (p=0,0000) раза.

Таким образом, результаты исследования и анализ данных позволяют лучше понять механизмы не только неолимфогенеза, но и взаимодействия лимфатической, а следовательно, и иммунной системы со злокачественной опухолью и ее метастазами.

Исходя их полученных данных, доказано, что ТЛУ имеют конкретные анатомические особенности структурной организации, что, в свою очередь, позволяет предположить отличные функциональные характеристики новообразованных лимфоидных структур. Учитывая многочисленные публикации, сообщающие о положительных иммунных реакциях и увеличении продолжительности жизни при наличии новообразованных лимфоидных структур у пациентов со злокачественными новообразованиями разных локализаций, можно сделать вывод о высокой противоопухолевой активности ТЛУ.

ОБСУЖДЕНИЕ

Впервые выявлен высокий метастатический потенциал саркомы М1, включая лимфогенное метастазирование, в экперименте на крысах линии вистар, визуализировны опухолевые клетки в пораженных метастазами лимфоузлах. Впервые выявлены морфологические особенности строения ТЛУ: меньший объем их коркового вещества, меньшее количество лимфоидных фолликулов и усиленное кровоснабжение. Средняя суммарная площадь кровеносных сосудов ТЛУ на 78% больше по сравнению с ВЛУ и на 92% больше по сравнению с МЛУ. Образующиеся при подкожной перевивке саркомы М1 ТЛУ имеют специфические иммуногистохимические признаки, заключающиеся в максимальной экспрессии маркеров CD3+, CD4+ и CD30+ клеток. В краевых синусах ТЛУ отмечается максимальное содержание CD4+ клеток (резко выраженная реакция) и 16-кратное увеличение по сравнению с другими группами лимфатических узлов числа CD30+ клеток (слабо выраженная реакция). Паракортикальные зоны ТЛУ содержат в среднем в 1,65 раза больше (p=0,0309) CD3+ клеток (резко выраженная реакция) и в 1,2 (p=0,0168) и 3,1 (p=0,0000) раза больше по сравнению с ВЛУ и МЛУ CD4+ клеток (резко выраженная реакция). Промежуточные синусы ТЛУ характеризуются максимальной экспрессией маркеров CD3+ и CD4+ (резко выраженная реакция), а также CD30+ клеток (слабо выраженная реакция). В лимфоидных фолликулах ТЛУ CD3+, CD30+ клетки показывают предельно высокие значения.

Полученные в данном исследовании результаты соотносятся с работами ученых, занимающихся изучением функционального и прогностического статуса третичных лимфоидных структур. ТЛС анатомически напоминают ВЛО, и первоначально предполагалось, что их образование в значительной степени будет индуцироваться одними и теми же стимулами. Однако пулы клеток и сигналы, которые обеспечивают индукционные стимулы для образования ТЛС, по крайней мере, частично отличаются. Например, несколько наблюдений показывают, что опухолеспецифический Т- и В-клеточный иммунитет может индуцировать некоторые молекулярные факторы, необходимые для образования и поддержания ТЛС, а гетерогенность этих драйверов может приводить к различным состояниям ТЛС [14].

ВЫВОДЫ

1. Проведенное исследование доказывает возможность воспроизведения третичных лимфатических узлов на модели экспериментальных животных с использованием перевивной саркомы М1.
2. Впервые выявлены анатомические особенности новообразованных лимфатических узлов в эксперименте.
3. По результатам морфометрических и иммуногистохимических исследований выявлены специ-фичные характеристики ТЛУ, что может говорить о высоком противоопухолевом потенциале новообразованных структур.

Конфликт интересов: все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

About the authors

Rasul A. Rustamkhanov

Bashkir State Medical University

Author for correspondence.
Email: weather86@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0355-1399

assistant of the Department of Oncology with the courses on oncology and pathological anatomy

Russian Federation, Ufa

Shamil R. Kzyrgalin

Bashkir State Medical University

Email: ufa.shamil@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9721-108X

PhD, Associate professor of the Department of Oncology with the courses on oncology and pathological anatomy

Russian Federation, Ufa

Dauranbek T. Arybzhanov

South Kazakhstan Medical Academy

Email: davran_a@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0237-9064

PhD, Associate professor of the Department of Surgical Disciplines

Kazakhstan, Shymkent

Kamil Sh. Gantsev

Bashkir State Medical University

Email: gantseff@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7562-5684

PhD, Professor of the Department of Oncology with the courses on oncology and pathological anatomy

Russian Federation, Ufa

Davlat S. Tursumetov

Bashkir State Medical University

Email: ufa.davlat@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4069-6594

PhD, Associate professor of the Department of oncology with the courses on oncology and pathological anatomy

Russian Federation, Ufa

Shamil Kh. Gantsev

Bashkir State Medical University

Email: prfg@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2047-963X

PhD, Professor, Head of the Department of Oncology with the courses on oncology and pathological anatomy

Russian Federation, Ufa

References

Supplementary files