Использование клеточных технологий в лечении цирроза печени (оценка эффективности и способ визуализации введенных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток)

Полный текст

МСК – мезенхимальная стромальная клетка;

МРТ – магнитно-резонансная томография.

 

ВВЕДЕНИЕ

Повреждение печеночной ткани в результате воздействия различных агентов (алкоголь, вирусы, лекарственные препараты и т.д.) стимулирует процесс образования соединительной ткани в печени и приводит к формированию фиброза и/или цирроза печени [1]. Заболеваемость циррозом печени растет ежегодно и в экономически развитых странах составляет от 20 до 40 человек на 100 тысяч населения. Цирроз печени занимает девятое место среди причин летальных исходов, при этом чаще данный диагноз ставится мужчинам (соотношение мужчин и женщин 3:1). По данным различных источников, цирроз печени алкогольной этиологии составляет от 40% до 80% от всех циррозов печени. На долю циррозов печени, развившихся на фоне вирусных гепатитов, приходится от 30% до 40%. Также существует категория больных (10–35%), у которых этиология цирроза печени так и остается неизвестной [2].

Основная терапия при циррозе печени связана с устранением причины возникновения цирроза печени, а также с влиянием на имеющиеся симптомы у пациентов [3]. Однако известно, что имеющаяся на данный момент терапия не дает значимо эффективного результата, а выполнение ортотопической пересадки печени все еще является достаточно сложной и дорогостоящей операцией. В связи с этим возникает потребность в поисках альтернативных методов лечения, одним из которых является использование клеточных технологий в лечении цирроза печени.

На сегодняшний день существует большое количество научных сообщений о применении стволовых клеток в лечении различных заболеваний, в том числе и при диффузных заболеваниях печени. Однако четкое представление о распределении вводимых клеточных структур в большинстве случаев существует лишь на уровне экспериментальных моделей. При этом ни у кого не возникает сомнений в том, насколько важно не только оценивать эффективность клеточной терапии, но и понимать, как происходит распределение введенных стволовых клеток в организме пациента.

В данной статье мы демонстрируем собственное клиническое наблюдение, в котором описывается эффективность применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в терапии цирроза печени, а также представляем возможность визуализации вводимых клеточных структур с последующим цитологическим подтверждением.

ЦЕЛЬ

Оценить эффективность использования клеточных технологий в лечении цирроза печени, визуализировать вводимые стволовые клетки в организме человека.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Получение первичных культур мезенхимальных стромальных клеток (МСК) жировой ткани

Все клинические процедуры и забор биологического материала осуществлялись в соответствии с этическими стандартами локального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. Первичные культуры мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани выделяли методом ферментации из фрагментов жировой ткани, полученных хирургическим путем. Забор ткани осуществлялся при наличии информированного согласия пациента. Фрагмент ткани механически измельчали, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и затем инкубировали в 0,1% раствором коллагеназы I и IV типов (Sigma, США) в течение 30 минут при 37°С (Thermofisher, USA). Полученную клеточную смесь затем центрифугировали (400g, 10 минут) и ресуспендировали клетки стромально-васкулярной фракции в культуральной среде DMEM (1 г/л глюкозы) (Thermofisher, USA) с добавлением 20% заменителя сыворотки HyClone (США), антибиотика пенициллина и антимикотика стрептомицина (оба – Gibco, США). Клетки высевали в культуральные флаконы (TPP, Швейцария) в количестве 1 – 4 • 10⁵ кл/см² и культивировали при 37°С, 5% CO₂ и 80% влажности в условиях гипоксии (7% O₂). Смену среды производили каждые 3 суток.

Проточная цитометрия

Анализ экспрессии поверхностных антигенов проводили с использованием следующих моноклональных антител: CD44-FITC/CD73-PE/CD9-PC5/CD105-PC7 и CD34-FITC/ CD117-PE/ CD14-PC5/ CD45-PC7 (все Beckman Coulter, США). Анализ проводили с помощью проточного цитометра Navios (Beckman Coulter, США), используя полупроводниковые диодные лазеры с длиной волны 488 и 638 нм, в соответствии с инструкциями производителя. Для определения жизнеспособности клетки окрашивали раствором 7AAD, не проникающего внутрь живых клеток, и подсчитывали процентное содержание неокрашенных клеток. Гейтирование графиков флуоресценции осуществляли по популяции живых клеток, не окрашенных раствором 7AAD, выделяя их по параметрам прямого и бокового светорассеяния.

Мечение клеток. Магнитная сепарация. Измерение скорости пролиферации

В работе использовались непокрытые наночастицы оксида железа (IONP, iron oxide nanoparticles), соответствующие ТУ 1791-003-36280340-2008 («Передовые порошковые технологии», Россия) и представляющие собой смесь частиц с суперпарамагнитными (SPION, superparamagnetic iron oxide nanoparticles) и ферромагнитными свойствами. В предыдущем исследовании мы показали, что размер данных частиц 14–130 нм, однако в клетках они часто образуют агрегаты размером до 2 мкм. Подготовка IONP производилась согласно описанному ранее протоколу [1]. Мечение клеток осуществляли с помощью предварительно обработанных ультразвуком частиц, которые добавляли в культуральную среду в концентрации 300 мкг/мл и инкубировали в течение 8 часов. Далее среду удаляли, снимали клетки с подложки, а меченые клетки отделяли методом магнитной сепарации с помощью магнитного миништатива (Силекс, Россия) и вносили в лунки 6-луночных планшетов в количестве 104 клеток на лунку. Кривую роста строили по стандартной методике, подсчитывая клетки в камере Горяева на 1, 2, 3 и 5 день после посева.

Способ введения клеточных структур и их визуализации

Клетки метили, как описано выше, при концентрации частиц 300 мкг/мл. Для первичной оценки 5х106 клеток ресуспендировали в 5 мл физиологического раствора и помещали в шприцы объемом 5 мл. Имеющиеся клеточные структуры были введены в артериальное русло печени путем эндоваскулярной хирургии. Через сутки после введения клеток пациенту была выполнена МРТ органов брюшной полости и грудной клетки. Сканирование проводили на магнитно-резонансных томографах Siemens Espree и PHILIPS Ingenia с напряженностью магнитного поля 1,5 Тл.

Локализация IONP в биоптатах печени после проведения терапии

Биоптаты ткани печени получали через 6 и 12 месяцев после проведения клеточной терапии. Биопсия была выполнена при помощи лапароскопии. Биопсии подвергались участки, в которых были визуализированы введенные клеточные структуры при помощи МРТ.

Для иммуногистохимического окрашивания биоптаты, полученные через 6 месяцев, заливали в парафиновые блоки и приготовляли срезы по стандартным протоколам клинико-лабораторной диагностики. Часть срезов дополнительно окрашивали с помощью качественной реакции на ионы железа (см. ниже). Локализацию ионов железа и классификацию клеток осуществляли при исследовании клеток с помощью микроскопа Zess Paskal.

Биоптаты, полученные через год тем же образом, использовали для получения первичных культур МСК и оценки содержания в них ионов Fe³⁺. Биоптаты ферментировали в 0,1% растворе коллагеназы I и IV типов (Sigma, США) в течение 50 минут при 37°С. Полученную клеточную смесь затем центрифугировали (400 g, 10 минут) и ресуспендировали в культуральной среде DMEM (1г/л глюкозы) (Thermofisher, USA) с добавлением 20% заменителя сыворотки HyClone (США), антибиотика пенициллина и антимикотика стрептомицина (оба – Gibco, США). Клетки высевали в культуральные флаконы (TPP, Швейцария) в количестве 1 – 4 • 10⁵ кл/см² и культивировали при 37°С, 5% CO₂ и 80% влажности в условиях гипоксии (7% O₂) в течение 24 часов. Далее клетки окрашивали реагентами для выявления ионов железа (III).

Верификация интернализации IONP с помощью гексацианоферрата калия K4 [Fe(CN)6]

Для выявления в клетках ионов железа (III) образцы клеточных культур и гистологические срезы обрабатывали гексацианоферратом калия K4 [Fe(CN)6] по стандартной методике [4]. Клетки отмывали от среды, фиксировали 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем вновь промывали в ФСБ и окрашивали смесью (1:1) 10% гексацианоферрата калия K4 [Fe(CN)6] и 20% HCl 40 минут.

При наличии в препарате клеток Fe³⁺ происходит образование комплексного соединения – берлинской лазури, KFe [Fe(CN)6]), соединения насыщенного синего цвета. После окрашивания препараты отмывали дистиллированной водой и анализировали с помощью инвертированного микроскопа EVOS (Thermofisher, США). При исследовании гистологических срезов биоптата печени окраске предшествовала депараффинизация с помощью ксилола. После окраски и отмывки стекла окрашивали красителем 0.1% Nuclear Fast Red (Sigma-Merck-Millipore) в течение 1 минуты, ополаскивали водой и заключали в заключающую среду HistoMount (Thermo Fisher).

Лабораторные и инструментальные методы диагностики

Перед началом лечения и через 6 месяцев после проведения терапии пациенту были выполнены контрольные клинический и биохимический анализы крови, эластография и MEGX тест. Для субъективной оценки состояния пациента выполнялся тест субъективной комфортности (А.Б. Леонова).

Все описанные исследования проводились в СЗГМУ им. И.И. Мечникова на основании положения о работе НИЛ клеточных технологий и договора с ООО «Покровский банк стволовых клеток» и протокола №4 этического комитета от 27.05.20 г.

Статистическая обработка данных

Для каждого образца эксперимент повторяли не менее трех раз. Для оценки значимости различий (p <0,05) при анализе пролиферативной активности использовали множественный t-test. Анализ полученных данных и построение графиков проводили в программе GraphPad Prism 7. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Пациент А., 55 лет, госпитализирован в хирургическое отделение клиники университета с диагнозом цирроз печени алиментарной этиологии класс А по Чайлд-Пью. Осложнениями основного заболевания у пациента явились: портальная гипертензия с варикозным расширением вен пищевода 1 ст., спленомегалия и гиперспленизм.

Для лечения данного пациента использовались клеточные технологии в виде введения в артериальное русло печени аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в количестве 25*10⁶. Пациенту в условиях стационара было выполнено введение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в артериальное русло печени (рисунок 1).

 

Рисунок 1. Целиография и мезентерикография пациента А. Стрелкой обозначена правая печеночная артерия, в которую вводились аутологичные мезенхимальные стволовые клетки.

 

Перед введением культура аутологичных мезенхимальных стволовых клеток была обработана наночастицами оксида железа. Для введения использовали полученные методом магнитной сепарации клетки, содержащие наночастицы, что в последующем дало возможность визуализировать введенные стволовые клетки в организме пациента при выполнении магнитно-резонансной томографии органов брюшной полости (рисунок 2). Через сутки после проведения клеточной терапии пациенту была выполнена МРТ органов брюшной полости и грудной клетки.

 

Рисунок 2. Магнитно-резонансная томография органов брюшной полости на 1 сутки после введения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в артериальное русло печени. Стрелкой указаны области печени, в которых визуализируются маркированные стволовые клетки.

 

На представленном снимке МРТ органов брюшной полости введенные стволовые клетки визуализируются в правой доле печени. При этом в каких-либо других органах брюшной полости, а также в грудной клетке клеточные структуры не выявлены.

Все выполненные процедуры пациент перенес удовлетворительно, каких-либо осложнений отмечено не было. В удовлетворительном состоянии пациент был выписан на амбулаторное наблюдение. Одним из условий участия пациента в лечении с использованием клеточных технологий был полный отказ от употребления алкоголя как до, так и после проведения терапии. Также в течение 6 месяцев после применения клеточных технологий пациент не использовал каких-либо гепатотропных препаратов. Через 6 месяцев после проведения лечения пациенту выполнялись контрольные исследования. Данные проведенных исследований до начала лечения и через 6 месяцев после проведения терапии (p <0,05) представлены в таблице 1.

 

	До начала терапии	Через 6 месяцев после проведения терапии
Тромбоциты (10∧9/л)	90,6	129,8
Эритроциты (10∧12/л)	3,5	4,8
Лейкоциты (10∧9/л)	3,3	6,9
Билирубин (мкмоль/л)	23,2	18,6
Альбумин (г/л)	32,4	49,5
АЛТ (Е/л)	65,2	20,7
АСТ (Е/л)	54,2	24,2
ЩФ (Е/л)	239,3	98,5
ГГТП (Е/л)	123,8	35,7
Тест субъективной оценки	сниженный уровень субъективного комфорта, пониженное самочувствие	высокий уровень субъективного комфорта, хорошее самочувствие
MEGX	значительное снижение функции печени	функция печени в нормальных пределах
Эластография	F4	F4–3

Таблица 1. Показатели лабораторных и инструментальных исследований до начала терапии и через 6 месяцев после проведения лечения

Table 1. Indicators of laboratory and instrumental examinations before the start of therapy and 6 months after the treatment

 

Как видно из представленных в таблице 1 данных, у пациента отмечается достаточно значимая положительная динамика – как в улучшении функции печени, так и в улучшении оценки субъективного состояния самочувствия. По данным эластографии печени, отмечалось лишь незначительное улучшение состояния паренхимы печени с сохранением проявлений цирроза печени. Через 6 месяцев после проведения терапии пациенту была выполнена биопсия печени из области печеночной ткани, в которой были визуализированы введенные клеточные структуры.

Оценка иммунофенотипа и жизнеспособности меченых МСК

После инкубации с IONP и последующей магнитной сепарацией в более чем 90% клеток культур были выявлены наночастицы при анализе методами световой микроскопии (рисунок 3А). Световая микроскопия позволяет выявить агрегаты частиц размером более 0,5 мкм. Способность частиц агрегировать в клетках была продемонстрирована нами ранее. Мы не исключаем, что остальные клетки также содержали IONP малых размеров, недостаточных для визуализации при световой микроскопии.

 

Рисунок 3. Анализ морфофункциональных свойств клеток, содержащих IONP. (А) Общий вид культуры МСК после обработки IONP, 300 мкг/мл. Масштабный отрезок – 50 мкм. Стрелками отмечены некоторые из IONP. (B) Результат иммунофенотипирования культур МСК после обработки IONP. (С) Диаграмма пролиферативной активности МСК, необработанных IONP (контроль) и обработанных IONP, 300 мкг/мл. Представлены результаты подсчета числа клеток в лунке (ось Y) в зависимости от дня культивирования (ось Х). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.

 

Согласно принятому определению мезенхимальных стволовых клеток, которое было предложено Международным обществом клеточной терапии, на мембране этого типа клеток выявляется определенный набор поверхностных лигандов [5], которые можно выявить с помощью проточной цитометрии после обработки клеток соответствующими антителами. Использованные в работе антитела указаны в разделе «Материалы и методы». При исследовании характера экспрессии поверхностных антигенов у мезенхимальных стволовых клеток после добавления IONP,
300 мкг/мл (рисунок 3B) достоверные различия в сравнении с референтными значениями не выявлялись.

По своей пролиферативной активности клетки с IONP соответствовали контрольным, не содержащим наночастиц (рисунок 3С).

Таким образом, включение наночастиц оксида железа не оказывало влияния на базовые характеристики мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани.

Локализация наночастиц до (в культурах МСК жировой ткани) и после (в гистологических срезах биоптата печени и культурах МСК биоптата) трансплантации

Для подтверждения того, что наблюдаемые включения являются именно наночастицами оксида железа (III), использовали окрашивание гексацианоферратом железа. Одним из преимуществ данного метода является возможность визуализировать присутствие в клетке IONP с размером менее 0,5 мкм. Частицы такого размера недоступны для наблюдения в световой микроскоп. Однако содержащие их клетки окрашиваются в яркий синий цвет.

Мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани в норме не содержат значимого количества Fe³⁺ и не окрашиваются данным реагентом. Обработанные IONP клетки содержали значительное количество интернализованных частиц оксида железа (III), окрашиваемых гексацианоферратом железа в синий цвет (рисунок 4А). При этом окраска наблюдалась только в цитоплазме, но не в ядре.

 

Рисунок 4. Исследование локализации IONP в клетках методом микроскопии препаратов, окрашенных гексацианоферратом железа (А, B, E) и неокрашенных (C, D): (А) в МСК после обработки IONP, 300 мкг/мл перед трансплантацией; (B) в клетках гистологического препарата биоптата печени, полученного через 6 месяцев после трансплантации; (С–D) в первичных культурах клеток биоптата до первого пересева (С – фибробластоподобная колония, D –  пителиоподобная колония) и после 2 пересевов (Е). Масштабный отрезок – 50 мкм. Стрелками отмечены некоторые из IONP.

 

В гистологических препаратах биоптатов печени, полученных из области трансплантации меченых МСК, наибольшее количество окрашенных клеток наблюдали в микроузлах печени, а также на границах микроузлов и фиброзных септ (рисунок 4B). В нормальных тканях печени железо (III) или отсутствует, или выявляется в небольших количествах. Содержание в гепатоцитах повышается при накоплении гемосидерина и развитии гемосидероза печени, что характерно для пациентов с циррозом печени алкогольной этиологии. Однако у данных пациентов гемосидероз диагностирован не был. Наличие окраски в гепатоцитах микроузлов позволяет предположить, что по крайней мере часть трансплантированных клеток, возможно, дифференцируется в гепатоцитарном направлении. Мезенхимальные стволовые клетки различного происхождения способны к такой трансдифференцировке, особенно при помещении их в условия, благоприятные для роста гепатоцитов или при локализации их в тканях печени [6, 7, 8]. Однако нельзя исключать и другие возможные причины попадания Fe³⁺ в гепатоциты.

Часть биоптата, полученного через 12 месяцев после трансплантации, использовали для получения первичных культур (рисунок 4C, E). До первого пересева культур в них выявляли колонии клеток как фибробластоподобной, так и эпителиальной морфологии. Оба типа колоний содержали частицы (рисунок 4С, D). Из-за малого количества материала окрашивания гексацианоферратом железа не проводили. Окрашивали клетки после 2–3 пересевов. В таких культурах клетки с эпителиальной морфологией уже не наблюдали, так как для их поддержания необходимы специальные среды.

Культуры клеток были однородны согласно данным иммунофенотипирования и состояли из мезенхимальных стволовых клеток. В этих клетках выявили IONP при окраске гексацианоферратом (рисунок 4E). Снижение количества метки связано с делением клеток и распределением частиц между дочерними клетками.

ОБСУЖДЕНИЕ

Отсутствие лекарственных средств, которые способны влиять на формирование фиброзной ткани в печени, а также значимо улучшать функциональное состояние печеночной ткани, приводит к поиску альтернативных способов лечения. Это особенно важно для хирургической практики, когда оперативному вмешательству на печени подвергаются пациенты, страдающие циррозом. Возможность улучшить функцию печеночной ткани является одним из важных факторов успешного течения послеоперационного периода у данной категории больных. Но прежде чем говорить об эффективности применения клеточных технологий, важно было понять, где и в каких органах фиксируются вводимые клеточные структуры. Для отслеживания клеток в организме реципиента используемые методы не должны нарушать жизнеспособность клеток и влиять на их способность к делению [9]. Предлагаемые на сегодняшний день способы по визуализации вводимых клеточных структур включают в себя неоптические, оптические и гибридные методы [10, 11]. Однако большинство из них продемонстрировано лишь на уровне экспериментальных моделей [12].

Продемонстрированный нами клинический пример дал возможность визуализировать вводимые клеточные структуры в организме человека, что позволяет, во-первых, говорить об эффективности предложенного способа введения клеточных структур, а во-вторых, показывает эффективность использования клеточной терапии в виде улучшения показателей лабораторных и инструментальных методов исследования.

Подобные результаты позволяют проводить дальнейшие клинические работы в данном направлении, изучать стойкость полученного эффекта и необходимость проведения повторных процедур.

ВЫВОДЫ

1. Вводимые через печеночную артерию клеточные структуры фиксируются непосредственно в ткани печени, что позволяет считать эффективным данный способ доставки стволовых клеток непосредственно к ткани печени.
2. Применяемые в качестве меток клеточных структур предложенные наночастицы оксида железа не влияют на базовые характеристики аутологичных мезенхимальных стволовых клеток.
3. Клеточная терапия оказывает положительное воздействие на функцию печени, однако практически не влияет на фиброзные изменения печеночной ткани.
4. При выполнении биопсии печени после проведения клеточной терапии было выявлено, что часть трансплантированных клеток дифференцируется в гепатоцитарном направлении. 

Об авторах

И. Е. Коткас

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: inna.kotkas@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4605-9887

к.м.н., доцент кафедры факультетской хирургии им. И.И. Грекова, зав. хирургическим отделением клиники им. Э.Э. Эйхвальда

Россия, Санкт-Петербург

Н. И. Енукашвили

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт цитологии Российской академии наук»

Email: inna.kotkas@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5971-7917

к.б.н., старший научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Ш. М. Асадулаев

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России

Email: inna.kotkas@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1915-1250

к.м.н., врач-хирург рентгеноэндоваскулярного кабинета

Россия, Санкт-Петербург

А. В. Чубарь

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт цитологии Российской академии наук»

Email: inna.kotkas@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4160-1385

м.н.с. лаб. некодирующей ДНК

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы