Histomorphometry as a method for assessing the healing of tubular bone fractures (review of Russian literature and own data)

Full Text

Введение. Согласно статистическим данным в Российской Федерации на травмы приходится второе место после заболеваний сердечно-сосудистой системы и первое место среди причин выхода на первичную инвалидность у пациентов в возрасте до 60 лет [1]. В настоящее время особенно актуально вопрос травматизма встает в условиях специальной военной операции, где преобладает сочетанный травматизм при минно-взрывных ранениях [2].

Учитывая социально-экономические последствия травм для государства, изучение вопросов репаративной регенерации костей является актуальным. Процесс заживления перелома кости является сложным, многоступенчатым и для его оценки используются рентгенологические, ультразвуковые методы [3], а также морфологические – световая микроскопия и гистоморфометрия.

Цель. Осуществить аналитический обзор отечественной научной литературы о гистоморфометрических методиках оценки заживления переломов трубчатых костей, а также дополнить эту тему собственными данными.

Материал и методы. Поиск научной литературы по теме статьи проведен с использованием НЭБ «Еlibrary» до 20.02.2025 года включительно. Источники литературы анализировались вне зависимости от даты, языка и типа публикации (полнотекстовый или реферативный). В изучаемых публикациях были проанализированы списки цитируемой литературы для расширения объема информации, включаемой в статью. Информационный поиск проводился по следующим ключевым словам: гистоморфометрия регенерата трубчатых костей, репаративный остеогенез трубчатых костей, регенерация трубчатых костей, заживление перелома трубчатых костей. Критериями исключения послужили указанные выше, но в других типах костей. В статью не вошли обзоры и мета-анализы по представленной тематике.

Для получения собственных данных было использовано 30 белых беспородных крыс-самцов половозрелого возраста с массой 200-210 г. (по 6 животных на каждый срок эксперимента). Перелом большеберцовых костей моделировался путем нанесения сквозного дырчатого дефекта (2,2 мм) электроинструментом, состоящим из твердосплавного бора для углового наконечника (производитель АО «ОЭЗ Владмива», Белгород, РФ) и эндодонтического мотора с наконечником и редукционной головкой X-Smart (производитель Dentsply, Maillefer, Швейцария) в проксимальном отделе диафиза под эфирным наркозом [4]. Сроки наблюдения после окончания оперативного вмешательства (3, 10, 15, 24, 45 сутки) устанавливали на основании ключевых сроков репаративного остеогенеза по Н.А. Коржу, Н.В. Дедух (2006) [5]. Для гистологического исследования производили выпиливание фрагмента большеберцовой кости между проксимальным эпифизом и диафизом, которые фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, декальцинировали 5% раствором муравьиной кислоты, обезвоживали в изопропиловом спирте возрастающей концентрации и заливали в гомогенизированную парафиновую среду «Histomix». Готовили гистологические срезы толщиной 5-6 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином, по Массону. Для визуальной оценки гистологических изменений на срезах, проведения замеров их структурных компонентов, а также фотографирования использовали программно-аппаратный комплекс, состоящий из персонального компьютера (программное обеспечение «Nis-Elements BR 4.60.00»), микроскопа «Nikon Eclipse Ni» и цифровой камеры «Nikon DS-Fi3» (Nikon Corporation, Japan). Замеры морфометрических параметров костного регенерата осуществляли в компьютерной программе NDP.view2 (Hamamatsu Photonics K.K., EU, Japan, UK, USA). Числовые данные загружали в лицензионную компьютерную программу «JASP» (версия 0.19.1.0, The JASP Team, Amsterdam) для проведения описательной статистики (для вычисления среднего значения параметров, стандартного отклонения, медианы, квартилей). В этой же программе проверяли нормальность распределения данных c использованием критерия Шапиро-Уилка. Учитывая ненормальное распределение данных для сравнения независимых групп в различные сроки эксперимента, применяли U-критерий Манна-Уитни для установления достоверности изменений. Доверительным интервалом для значений считали 95%.

Результаты. Результаты обзора методик гистоморфометрии регенерата трубчатых костей представляются в хронологическом порядке. Учитывая то, что репаративный остеогенез как процесс имеет свои особенности течения при разных типах переломов костей, указывали способ их моделирования. Также, поскольку результаты ручных и автоматизированных замеров могут значительно отличаться, в описании указан вид оборудования для морфометрии и использованное ПО. Учитывая диапазон возможностей различных гистологических окрасок в плане идентификации структурных компонентов костного регенерата указывали использованный их тип.

Силантьева А.Т. и др. (2003) дают оценку процесса образования регенерата, формирующегося между проксимальным и дистальным концами костей голени собак после их поперечного перелома на основании расчета коэффициента компактизации регенерата (доля корковой пластинки в поперечном срезе регенерата), коэффициента формы регенерата (соотношение поперечного размера регенерата и поперечного размера костного отломка), коэффициента структуры регенерата (доля костных отделов в общей площади регенерата), индекса плотности компактной и губчатой костной ткани (содержание вещества компактной и губчатой костной ткани на срезе регенерата). На основании данных показателей далее рассчитываются динамические параметры костеобразования: индекс содержания костного вещества в регенерате до начала формирования корковой пластинки и на этапе ее формирования [6].

Анников В.В. и др. (2005) моделировали поперечный перелом костей голени у кроликов и при помощи окулярной сетки на гистологических срезах определяли отношение объема образованной кости к таковому в других типах тканей (соединительной, хрящевой), относительную площадь, занимаемую последними, отношение протяженности костных трабекул, занятых активными остеобластами к их общей протяженности, а также его клеточный состав (количество гистиоцитов, фибробластов, общее число остеобластов, клеток воспалительного ряда) [7].

Дедух Н.В. и др. (2009) на модели сквозного дырчатого дефекта в дистальном метафизе бедренной кости крыс методом морфометрии по Г.Г. Автандилову предлагают определять количество тканевых базофилов, нейтрофилов, плазмоцитов, лимфоцитов, фибробластов, малодифференцированных клеток на 1, 2, 3 сутки после создания перелома и площадь грануляционной, фиброретикулярной, грубоволокнистой костной, пластинчатой костной тканей, материнской кости и детрита, костного мозга на 5, 7, 14, 21, 28 сутки [8]

Слисаренко А.В. и др. (2013) оценивали морфофункциональное состояние регенерата на 7, 15 и 24 сутки после нанесения дырчатого дефекта в середине диафиза большеберцовых костей путем измерения таких цито- и гистоморфометрических параметров как процент фибробластов, макрофагов, лимфоцитов, плазмоцитов, нейтрофилов, малодифференцированных клеток среди общего числа клеток, а также процентное содержание грануляционной, фиброретикулярной, грубоволокнистой и пластинчатой костной тканей. Морфометрические замеры проводили в компьютерной программе «SEO imageLab» на гистологических срезах, окрашенных гематоксилин-эозином и по Романовскому-Гимзе [9].

Ашукина Н.О. и др. (2013) на гистологических срезах регенерата, формирующегося в дырчатом дефекте середины диафиза бедренной кости крыс и окрашенных гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону при помощи квадратно-сетчатой окулярной вставки микроскопа определяли относительную площадь гематомы, костной, фиброретикулярной, грануляционной тканей и костного мозга и далее рассчитывали их процентное отношение к общей площади всех тканей в области дефекта. Измерения проводили на 3, 7, 14 и 21 сутки после создания модели перелома бедренной кости [10].

Лебединский В.Ю. и др. (2015), Михайлов И.Н. и др. (2015) в эксперименте на кроликах предлагают рассчитывать следующие морфометрические параметры дистракционного регенерата локтевой и лучевой костей: относительный объем сосудов и тканевых структур с вычислением в последних количества клеток и межклеточного вещества (с расчётом оссифицированных и неоссифицированных структур). Авторами предложены такие морфометрические индексы как сосудисто-тканевое отношение, клеточно-тканевое отношение, индекс оссификации. Первые два индекса представляют собой соответственно отношение относительного объема сосудов и клеток к количеству тканевых структур, а третий – отношение числа оссифицированных структур к неоссифицированным. В последних определяли количество клеток и межклеточного вещества. Измерения проводили при помощи окулярной сетки и системы анализа изображений на срезах, окрашенных гематоксилин-эозином [11, 12, 13].

Ковальчук П.Е. и др. (2015) после моделирования перелома в проксимальном метафизе бедренной кости путем нанесения сквозного дырчатого дефекта предлагают определять процент заполнения дефекта новообразованной костной тканью на 7, 15, 30 сутки репаративного остеогенеза. Данный параметр авторы определяли планиметрично на цифровом изображении гистологического среза с помощью измерительной сетки и выражали в процентах [14].

Кореньков О.В. (2016) для оценки заживления дырчатого дефекта в диафизе большеберцовых костей крыс предлагает определять отношение площади костной и соединительной тканей к общей площади костного дефекта с использованием программ анализа изображений «Видео-Тест» и «Видео-Размер». Анализ осуществлялся на 15 и 30 сутки после перелома на гистологических срезах, окрашенных гематоксилин-эозином [15].

Шпаковский М.С. и др. (2016) в качестве морфометрических параметров оценки заживления перелома шейки бедренной кости кроликов предлагают измерять площадь поверхности костных трабекул, численную плотность остеобластов, остеоцитов, остеокластов, сосудов, пролиферирующих остеобластов, клеток эндотелия. Замеры осуществлялись на 7, 14, 30, 60 сутки после операции на срезах, окрашенных гематоксилином-эозином и по Ван Гизону с использованием программы Axioplan 2 imaging (Carl Zeiss, Германия) [16].

Шищук В.Д. и др. (2018) на 3 сутки после создания сквозного дефекта в середине диафиза большеберцовых костей крыс предлагают осуществлять замер клеточного состава регенерата, а именно количества фибробластов, нейтрофилов, лимфоцитов, плазмоцитов, макрофагов, малодифференцированных клеток, а на 15, 24 сутки – процентного содержание грануляционной, фиброретикулярной, грубоволокнистой и пластинчатой тканей. В последних двух осуществлялся замер толщины костных трабекул в центре и на периферии регенерата, а также общей площади и диаметра сосудов во всех из них. Морфометрические замеры осуществлялись с помощью программ «видео тест 5,0» и «видео размер 5,0» на гистологических срезах, окрашенных гематоксилин-эозином (15, 24 сутки) и по Романовскому-Гимзе (3 сутки) [17].

Горбач Е.Н. (2019) изучала морфометрические параметры кровеносных сосудов проксимального и дистального костных отломков, аналогичных отделов регенерата и зоны между ними у собак после моделирования поперечного перелома середины диафиза большеберцовых костей. На гистологических срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, орсеином по Тенцеру-Унну при помощи программы «ВидеоТесТ-Морфология 4.0» (Россия) измеряла диаметр сосудов и численную плотность сосудов артериального и венозного типа, определяла количество артерий, артериол, венул и вен [18].

Сучков Д.И. и др. (2019) моделировали окончатый дефект в средней трети бедренной кости крыс и измеряли такие параметры как количество сосудов, количество и соотношение клеток остеоцитарного дифферона (остеоциты, остеобласты, остеокласты), площадь костного мозга, волокнистой ткани, количество клеток воспалительного ряда и клеток инородных тел. Измерения авторами проведены в программе ImageJ (NIH, США) на гистологических срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону на 14, 21, 28 сутки после моделирования перелома [19].

Надыров Э.А. и др. (2019) предлагают осуществлять замер таких морфометрических параметров регенерата большеберцовых костей крыс как площадь некрозов, грануляционной ткани, костных трабекул на гистологических срезах, окрашенных гематоксилин-эозином [20]. 

Собственные данные. На 3 сутки эксперимента в области дефекта выявляется участок гематомы, который окружают грануляционная, фиброретикулярная ткани (Рисунок 1). Причем в последней выявляются очаги грубоволокнистой ткани.

В области гематомы определяются фибриновые волокна, которые фрагментируют данную область, отделяют ее от грануляционной ткани и ограничивают дальнейшее распространение в окружающие ткани форменных элементов крови. Между волокнами выявляются разрушенные или разрушающиеся форменные элементы крови, мышечные волокна и костные отломки. При этом на периферии гематомы определяются единичные сосуды.

В грануляционной ткани, окружающей гематому, клетки располагаются рыхло. Клеточный состав разнообразен. Определяются фибробласты, макрофаги, лимфоциты, малодифференцированные клетки, капилляры в разном сечении.

Фиброретикулярная ткань представлена неорганизованным скоплением клеток и волокон, между которыми располагаются сосуды. Следует отметить, что клеток больше, чем волокон, а структурные компоненты фиброретикулярной ткани, окружающие грануляционную ткань, располагаются вдоль последней в виде слоя (организованный слой фиброретикулярной ткани). Со стороны компактной кости в фиброретикулярной ткани структурные компоненты располагаются пучками в разных направлениях (безостровковый неорганизованный слой фиброретикулярной ткани) и между ними появляются вытянутой формы участки грубоволокнистой ткани. Данные участки окружены остеобластами и состоят из организованных в пучки неплотно расположенных коллагеновых волокон.

Участок компактной кости, который прилежит к области дефекта, содержит лакуны без остеоцитов. Красный костный мозг, контактирующий с данной областью, содержит крупные мегакариоциты.

Гистоморфометрия регенерата большеберцовых костей на 3 сутки эксперимента показала, что его общая площадь составляет 10,480 [10, 317;10, 710] мм², площадь, занимаемая гематомой в регенерате – 6,250 [5, 942;6, 513] мм², площадь, занимаемая грануляционной тканью – 1,790 [1, 698;1, 875] мм², фиброретикулярной тканью – 1,615 [1, 530;1, 685] мкм², грубоволокнистой костной тканью – 0,885 [0, 807;0, 932] мм², что в процентном выражении составляет соответственно 60%, 17%, 15%, 8% от общей площади регенерата.

 

Рисунок 1. Участок регенерата большеберцовой кости после нанесения в ней сквозного дырчатого дефекта на 3 сутки эксперимента: А – участок большеберцовой кости с регенератом, Б – гематома, в которой встречаются  остатки мышечных волокон (1) с сосудами (2), В – грануляционная ткань, содержащая сосуд (2), фибробласт (3), макрофаг (4), лимфоцит (5), Г – участок организованной (6) и безостровковой неорганизованной (7) фиброретикулярной ткани содержащий участки типичной грубоволокнистой ткани (8), которые прилежат к грануляционной ткани (9), Д – участок  безостровковой неорганизованной фиброретикулярной ткани, контактирующий с красным костным мозгом, 10 – мегакариоциты. Окраска: гематоксилин-эозин (А-В, Д), по Массону (Г).

Figure 1. Tibial bone regeneration site after applying a hole defect in it on the 3^rd day of the experiment (A, Б): A – area of the tibia with regenerate, Б – hematoma in which remnants of muscle fibers (1) with vessels (2), В – granulation tissue containing a vessel (2), fibroblast (3), macrophage (4), lymphocyte (5), Г – area of an organized (6) and non-insular disorganized (7) fibroreticular tissue containing areas of typical woven bone (8) that adhere to granulation tissue (9), D – area of non-insular disorganized fibroreticular tissue in contact with red bone marrow, 10 – megakaryocytes. Staining: hematoxylin-eosin (А-В, Д), according to Masson (Г).

 

По структуре область дефекта на 10 сутки эксперимента аналогична таковой на 3 суткам, но по периферии фиброретикулярной ткани появляется пластинчатая ткань (Рисунок 2). Причем следует отметить, что ткани регенерата формируются равномерно по всей окружности области дефекта.

По структуре и расположению область гематомы, грануляционная и фиброретикулярная ткани сходны с таковыми на 3 сутки эксперимента.

При этом в грануляционной ткани были выявлены единичные мышечные волокна, в которых определяется исчерченность.

Со стороны пластинчатой ткани грубоволокнистая ткань определяется в виде разветвленных, связанных друг с другом участков неправильной формы, окружающих скопления фиброретикулярной ткани, которая формирует островковый неорганизованный слой фиброретикулярной ткани.

Вышеуказанные участки фиброретикулярной ткани образованы рыхлыми скоплениями пучков коллагеновых волокон, а также фибробластов с фиброцитами и переходят в плотноупакованные скопления коллагеновых волокон с аналогичными клетками и остеокластами, образуя трабекулы пластинчатой ткани. Причем пространства между пучками у первой заполнены фиброретикулярной тканью, а у второй – красным костным мозгом. На поверхности трабекул пластинчатой кости определяются остеокласты.

Следует отметить, что на периферии регенерата участки грубоволокнистой и пластинчатой костной ткани начинают разрушаться (по структуре соответствуют разрушающимся костным отломкам на 3 сутки эксперимента в области гематомы, на поверхности разрушающихся структур определяются остеокласты), а на их месте остаются костно-мозговые полости заполненные фиброретикулярной тканью или красным костным мозгом соответственно. Таким образом, можно выделить типичную грубоволокнистую и пластинчатую костные ткани с неизмененным строением, а также нетипичную, а именно измененную ткань с разрушенными или разрушающимися структурными компонентами.

Особенности структурных компонентов кости, окружающих регенерат в области дефекта, сохраняются такие же, как и на 3 сутки.

Рисунок 2. Участок регенерата большеберцовой кости после нанесения в ней сквозного дырчатого дефекта на 10 сутки эксперимента: А – участок большеберцовой кости с регенератом, Б – гематома содержащая фибриновые волокна (1), В – грануляционная ткань содержащая сосуд (2), фибробласт (3), макрофаг (4), лимфоцит (5), Г – участок грануляционной ткани с мышечными волокнами (6), Д – участок организованной (7) и островковой (8) неорганизованной фиброретикулярной ткани содержащий участки типичной грубоволокнистой ткани (9), Е – участок типичной грубоволокнистой ткани, окружающей костно-мозговые полости с островковой неорганизованной фиброретикулярной тканью, переходящий в типичную пластинчатую ткань (10), окружающую костно-мозговые полости с красным костным мозгом (11), Ж – участок типичной пластинчатой костной ткани регенерата с окружающим регенерат красным костным мозгом, 12 – остеобласты, 13 – остеоцит, 11 – костно-мозговая полость с красным костным мозгом, 12 – костные трабекулы типичной пластинчатой костной ткани, 14 – остеокласт, 15 – мегакариоциты. Окраска: гематоксилин-эозин (А-Г, Е, Ж), по Массону (Д).

Figure 2. The tibial bone regeneration site after applying a hole defect in it on the 10^th day of the experiment: A – area of the tibia with regenerate, Б – hematoma containing fibrin fibers (1), В – granulation tissue containing a vessel (2), fibroblast (3), macrophage (4), lymphocyte (5), Г – area of granulation tissue with muscle fibers (6), Д – organized (7) and insular (8) disorganized fibroreticular tissue containing areas of typical woven bone (9), Е – section of typical woven bone surrounding bone marrow cavities with insular disorganized fibroreticular tissue, turning into typical lamellar bone (10) surrounding bone marrow cavities with red bone marrow (11), Ж – area of typical lamellar bone of the regenerate with red bone marrow surrounding it, 12 – osteoblasts, 13 – osteocyte, 11 – bone marrow cavity with red bone marrow, 12 – bone trabeculae of typical lamellar bone, 14 – osteoclast, 15 – megakaryocytes. Staining: hematoxylin-eosin (А-Г, Е, Ж), according to Masson (Д).

 

На 10 сутки эксперимента общая площадь регенерата составляет 11,500 [11, 343;11, 665] мм², площадь, занимаемая гематомой в регенерате – 0,140 [0, 115;0, 165] мм², площадь, занимаемая грануляционной тканью – 0,890 [0, 813;1, 020] мм², фиброретикулярной тканью – 2,370 [2, 295;2, 625] мм², грубоволокнистой костной тканью – 1,720 [1, 662;1, 823] мм², пластинчатой костной тканью – 3,630 [3, 507;3, 730] мм², костно-мозговыми полостями - 2,535 [2, 450;2, 710] мм², что в процентном выражении составляет соответственно 1%, 8%, 21%, 15%, 32%, 23% от общей площади регенерата. По сравнению с 3 сутками на 10 сутки эксперимента общая площадь регенерата увеличилась на 1,09% (р=0,004), площадь гематомы уменьшилась на 97,77% (р=0,002), площадь грануляционной ткани – на 48,93% (р=0,002). При этом площадь фиброретикулярной ткани увеличилась на 56,58% (р=0,002), а грубоволокнистой костной – на 201,139% (р=0,005).

Область дефекта на 15 сутки эксперимента отличается от таковой на 3 и 10 сутки отсутствием гематомы. Причем следует отметить, что ткани регенерата формируются равномерно по всей окружности области дефекта.

По структуре и расположению область грануляционной, фиброретикулярной, грубоволокнистой и пластинчатой тканей сходны с таковыми на 10 сутки эксперимента.

При этом в грануляционной ткани также были выявлены поодиночке расположенные мышечные волокна, в которых определяется исчерченность. В последних встречаются скопления ядер в одном из участке саркоплазмы (Рисунок 3).

Организованный слой фиброретикулярной ткани непосредственно граничит с типичной грубоволокнистой тканью, а островковый неорганизованный располагается в полостях последней.

Следует отметить, что на периферии регенерата определяются как типичная, так и нетипичная (разрушающаяся) пластинчатая костная ткань (аналогичная морфологическая картина выявляется на 10 сутки), а на месте последней остаются костно-мозговые полости, заполненные красным костным мозгом. Рядом с нетипичной пластинчатой костной тканью выявляются остеокласты.

На 15 сутки эксперимента общая площадь регенерата составляет 10,210 [10, 105;10, 503] мм², площадь, занимаемая грануляционной тканью – 0,770 [0, 637;0, 858] мм², фиброретикулярной тканью – 2,445 [2, 308;2, 508] мкм², грубоволокнистой костной тканью – 2,065 [1, 987;2, 165] мм², пластинчатой костной тканью – 2,160 [2, 032;2, 295] мм², костно-мозговыми полостями – 2,925 [2, 768;3, 052] мм², что в процентном выражении составляет соответственно 7%, 23%, 20%, 21%, 29% от общей площади регенерата. В сравнении с 10 сутками на 15 сутки эксперимента общая площадь регенерата уменьшилась на 10,08% (р=0,004), площадь грануляционной ткани – на 17,30% (р=0,180), площадь фиброретикулярной ткани – на 2,51% (р=0,937). Площадь грубоволокнистой костной ткани увеличилась на 17,64% (р=0,013), пластинчатой костной ткани – уменьшилась на 40,22% (р=0,002), а площадь костно-мозговых пространств увеличилась на 13,55% (р=0,026).

Область дефекта на 24 сутки, как и на 15 сутки эксперимента отличается от таковой на 3 и 10 сутки отсутствием гематомы. Причем следует отметить, что ткани регенерата формируются равномерно по всей окружности области дефекта.

По структуре и расположению область грануляционной, фиброретикулярной, грубоволокнистой и пластинчатой тканей сходны с таковыми на 15 сутки эксперимента.

При этом в грануляционной ткани также были выявлены поодиночке расположенные мышечные волокна, в которых определяется исчерченность.

Рисунок 3. Участок регенерата большеберцовой кости после нанесения в ней сквозного дырчатого дефекта на 15 сутки эксперимента: А – участок большеберцовой кости с регенератом, Б – участок регенерата с грануляционной тканью (1), с организованной фиброретикулярной тканью (2), с типичной грубоволокнистой тканью (3), содержащей костно-мозговые полости с островковой неорганизованной фиброретикулярной тканью (4), с типичной (5) и нетипичной (6) пластинчатой тканью, окружающими полости с красным костным мозгом (7), В – участок регенерата, содержащий типичную и нетипичную пластинчатую ткань, окружающую костно-мозговые полости с красным костным мозгом, Г – участок грануляционной ткани, 8 – остеокласт, 9 – мышечное волокно. Окраска: гематоксилин-эозин.

Figure 3. Tibial bone regeneration site after applying a hole defect in it on the 15^th day of the experiment: A – area of the tibia with regenerate, Б – area of regenerate with granulation tissue (1), with organized fibroreticular tissue (2), with typical woven bone (3) containing bone marrow cavities with insular disorganized fibroreticular tissue (4), with typical (5) and atypical (6) lamellar bone surrounding cavities with red bone marrow (7), В – regenerate site containing typical and atypical lamellar bone surrounding bone marrow cavities with red bone marrow, Г – granulation tissue site, 8 – osteoclast, 9 – muscle fiber. Staining: hematoxylin-eosin.

 

Организованный слой фиброретикулярной ткани непосредственно граничит с типичной грубоволокнистой тканью, а островковый неорганизованный располагается в полостях последней.

Следует отметить, что на периферии регенерата определяются как типичная, так и нетипичная пластинчатая костная ткань (аналогичная морфологическая картина выявляется на 15 сутки), а на месте последней остаются костно-мозговые полости, заполненные красным костным мозгом (Рисунок 4).

На 24 сутки эксперимента общая площадь регенерата составляет 10,430 [10, 037;10, 688] мм², площадь, занимаемая грануляционной тканью – 0,655 [0, 592;0, 748] мм², фиброретикулярной тканью – 0,430 [0, 405;0, 485] мм², грубоволокнистой костной тканью – 0,575 [0, 505;0, 638] мм², пластинчатой костной тканью – 2,115 [2, 092;2, 242] мм², костно-мозговыми полостями – 6,505 [6, 030;7, 107] мм², что в процентном выражении составляет соответственно 6%, 4%, 6%, 21%, 63% от общей площади регенерата. В сравнении с 15 сутками на 24 сутки эксперимента общая площадь регенерата увеличилась на 0,69% (р=0,818), площадь грануляционной ткани уменьшилась на 12,56% (р=0,296), площадь фиброретикулярной ткани – на 81,64% (р=0,002), площадь грубоволокнистой костной ткани – на 62,41% (р=0,002), площадь пластинчатой костной ткани – на 0,62% (р=0,748), а площадь костно-мозговых пространств увеличилась на 224,79% (р=0,002).

Рисунок 4. Участок регенерата большеберцовой кости после нанесения в ней сквозного дырчатого дефекта на 24 сутки эксперимента: А – участок большеберцовой кости с регенератом, Б – участок регенерата с грануляционной тканью (1), с организованной фиброретикулярной тканью (2), с типичной грубоволокнистой тканью (3), содержащей костно-мозговые полости с островковой неорганизованной фиброретикулярной тканью (4), с типичной (5) и нетипичной (6) пластинчатой тканью, окружающими полости с красным костным мозгом (7), В – участок грануляционной ткани с организованной фиброретикулярной тканью, Г – участок регенерата, содержащий типичную и нетипичную пластинчатую ткань, окружающую костно-мозговые полости с красным костным мозгом, 8 – мышечное волокно в грануляционной ткани, 9 – пустая лакуна. Окраска: гематоксилин-эозин.

Figure 4. Tibial bone regeneration site after applying a hole defect in it on the 24^th day of the experiment: A – area of the tibia with regenerate, Б – area of regenerate with granulation tissue (1), with organized fibroreticular tissue (2), with typical woven bone (3) containing bone marrow cavities with insular disorganized fibroreticular tissue (4), with typical (5) and atypical (6) lamellar bone surrounding cavities with red bone marrow (7), В – area of granulation tissue with organized fibroreticular tissue, Г – regenerate site containing typical and atypical lamellar bone surrounding bone marrow cavities with red bone marrow, 8 – muscle fiber in granulation tissue, 9 – empty lacuna. Staining: hematoxylin-eosin.

Область дефекта на 45 сутки эксперимента отличается от таковой на 24 сутки отсутствием грануляционной ткани (Рисунок 5). Причем следует отметить, что ткани регенерата формируются равномерно по всей окружности области дефекта.

По структуре и расположению область фиброретикулярной, грубоволокнистой и пластинчатой тканей сходны с таковыми на 24 сутки эксперимента.

Следует отметить, что на периферии регенерата определяются как типичная, так и нетипичная пластинчатая костная ткань (аналогичная морфологическая картина выявляется на 24 сутки), а на месте последней остаются костно-мозговые полости, заполненные красным костным мозгом.

На 45 сутки эксперимента общая площадь регенерата составляет 10,990 [9, 973;12, 173] мм², площадь, занимаемая фиброретикулярной тканью – 0,420 [0, 368;0, 495] мм²_, грубоволокнистой костной тканью – 0,400 [0, 368;0, 495] мм², пластинчатой костной тканью – 2,850 [2, 732;3, 042] мм², костно-мозговыми полостями – 7,320 [6, 505;8, 210] мм², что в процентном выражении составляет соответственно 4%, 4%, 26%, 66% от общей площади регенерата.

Рисунок 5. Участок регенерата большеберцовой кости после нанесения в ней сквозного дырчатого дефекта на 45 сутки эксперимента: А – участок большеберцовой кости с регенератом, Б – участок регенерата с организованной фиброретикулярной тканью (1), с типичной грубоволокнистой тканью (2), с типичной (3) и нетипичной (4) пластинчатой тканью, окружающими полости с красным костным мозгом (5), В – участок регенерата, содержащий типичную и нетипичную пластинчатую ткань, окружающую костно-мозговые полости с красным костным мозгом. Окраска: гематоксилин-эозин.

Figure 5. The tibial bone regeneration site after applying a hole defect in it on the 45^th day of the experiment (A, Б): A – area of the tibia with regenerate, Б – area of regenerate with organized fibroreticular tissue (1), with typical woven bone (2), with typical (3) and atypical (4) lamellar bone surrounding cavities with red bone marrow (5), В – area of regenerate containing typical and atypical lamellar bone surrounding bone marrow cavities with red bone marrow. Staining: hematoxylin-eosin.

 

В сравнении с 24 сутками на 45 сутки эксперимента общая площадь регенерата увеличилась на 6,95% (р=0,485) (Рисунок 6), площадь фиброретикулярной ткани уменьшилась на 2,65% (р=0,873), площадь грубоволокнистой костной ткани – на 29,65% (р=0,009), площадь пластинчатой костной ткани увеличилась на 33,31% (р=0,002), а площадь костно-мозговых пространств – на 12,93% (р=0,240).

Рисунок 6. График «Дождевые облака», отражающий динамику изменений площади регенерата большеберцовых костей в течение разных фаз репаративного остеогенеза (а – с 3 по 10 сутки, б – с 10 по 15 сутки, в – с 15 по 24 сутки, г – с 24 по 45 сутки)

Figure 6. Graph «Rain clouds», reflecting the dynamics of changes in the area of tibial regenerate during different phases of reparative osteogenesis (a – from 3 to 10 days, б – from 10 to 15 days, в – from 15 to 24 days, г – from 24 to 45 days)

 

Обсуждение. Исходя из вышеизложенного, единой общепринятой гистоморфометрической методики оценки заживления переломов трубчатых костей не существует. Это обусловлено использованием авторами разных способов моделирования переломов костей (полный поперечный или циркулярный дефект с сохранением нагрузки на конечность), что определяет морфологические особенности течения процесса остеорепарации; методических подходов к измерениям (окулярная измерительная сетка или современные компьютерные программы для морфометрии); изучением гистологического строения регенерата на разных сроках его формирования. В ранние сроки после перелома (3 сутки) проводимые измерения касаются гематомы и ее клеточного состава, а в остальные сроки (10 сутки и более) – параметров формирующихся и постепенно замещающих друг друга тканей (грануляционной, фиброретикулярной, грубоволокнистой и пластинчатой костной) и их структурных компонентов.

Грануляционная ткань является разновидностью соединительной ткани, которая развивается на месте фибринового сгустка, начиная с периферических отделов гематомы. Ее основными клетками являются фибробласты, миофибробласты, происходящие как из рядом расположенных соединительных тканей, так и дифференцирующиеся из клеток-предшественников или мезенхимальных стволовых клеток, мигрирующих в зону перелома. Аморфное вещество грануляционной ткани характеризуется высокой степенью гидратации, в котором коллагеновые волокна состоят из коллагена третьего типа (более быстрый синтез, но меньшая механическая прочность) без присутствия эластических волокон. Наряду с формированием аморфного вещества и коллагеновых волокон происходит новообразование кровеносных капилляров [21].

Далее в процессе заживления перелома из-за пролиферации клеток фибробластического дифферона и постепенного созревания коллагеновых волокон (замещение коллагена третьего типа первым типом) формируется фиброретикулярная ткань, представленная беспорядочно ориентированными тяжами из данных клеток и волокон. В периферических отделах регенерата по мере течения процесса остеорепарации появляются участки грубоволокнистой костной ткани, которые характеризуются упорядоченным расположением разных по толщине пучков коллагеновых волокон, ориентированных вдоль силовых линий кости. Они являются основой формирования трабекул грубоволокнистой костной ткани, в которых число остеоцитов и размер лакун, в которых они локализуются выше, чем в зрелой пластинчатой костной ткани. Если между формирующимися трабекулами грубоволокнистой костной ткани пространства выполнены фиброретикулярной тканью, то в пластинчатой аналогичные полости заполнены костным мозгом [22].

Анализируя определяемые авторами гистоморфометрические параметры в разные сроки репаративного остеогенеза становится очевидным их важность в количественной оценке процесса заживления перелома трубчатой кости. Динамика изменений таких параметров как количество фибробластов, малодифференцированных клеток в области гематомы среди общего количества клеток, численная плотность сосудов, а также процентное содержание формирующихся грануляционной ткани, а затем фиброретикулярной, грубоволокнистой костной и пластинчатой костной тканей отражает нормальный, взаимосвязанный ступенчатый процесс формирования регенерата от ранних сроков к поздним и выключение из процесса какого-то одного компонента обязательно приводит к количественным изменениям других. Как пример, нарушение нормального кровоснабжения области перелома ведет к изменению направления остеогенеза в сторону формирования хрящевой ткани, не обладающей теми прочностными характеристиками как зрелая костная ткань. В настоящей работе установлено наличие мышечных волокон с поперечной исчерченностью в структуре грануляционной ткани, которые предположительно задействованы в ограничении и уменьшении области гематомы из-за своих сократительных свойств, а также могут обеспечивать недостающую коллагену третьего типа механическую прочность грануляционной ткани.

Немаловажная роль других клеток гематомы в процессах структурной реорганизации гематомы. Макрофаги, также как и лимфоциты синтезируют и секретируют ангиогенные и клеточные ростовые факторы, инициирующие фиброплазию и новообразование кровеносных сосудов в области перелома. Эндотелиальные клетки могут выступать источником развития клеток-предшественников остеогенной линии, выделяют эндотелиальные факторы роста, стимулирующие их пролиферацию. Также эндотелиальные клетки, как и макрофаги, выделяют тромбоцитарный фактор роста, стимулирующий пролиферацию фибробластов и синтез ими коллагена, хемотаксис мезенхимальных стволовых и клеток воспалительной линии. Следует учитывать и роль макрофагов наряду с нейтрофилами в фагоцитозе клеточного детрита и бактерий в области перелома [23]. Исходя из этого, подсчитываемое количество указанных выше типов клеток среди общей популяции клеток гематомы является индикатором интенсивности процесса структурной перестройки гематомы и формирования тканеспецифических структур.

Известно, что после травмы область перелома окружена скоплениями активированных тромбоцитов, которые высвобождают фактор роста тромбоцитов, эндотелиальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста-1 и 2, трансформирующий фактор роста-β. Первый и последний стимулируют хемотаксис, пролиферацию и дифференцировку клеток остеогенной линии [24].

В формирующейся грубоволокнистой костной, а затем пластинчатой костной тканях важную информацию о процессе новообразования костной ткани в области перелома дает динамика изменений таких параметров как количество и соотношение клеток остеоцитарного дифферона (остеоциты, остеобласты, остеокласты). В частности, примером основного критерия баланса новообразования и костной резорбции может служить такой параметр как отношение площади, занимаемой остеокластами к таковой, занимаемой остеобластами, а также отношение количества остеобластов к таковому остеокластов [25].

Заключение. Несмотря на разные подходы исследователей к количественной оценке заживления перелома трубчатых костей, обусловленные выбором различных способов их моделирования, методических подходов к морфометрии, разных сроков для изучения его формирования на светооптическом уровне невозможно представить без морфометрических замеров постепенно замещающих друг друга тканеспецифических структур в зоне остеорепарации – гематомы, грануляционной, фиброретикулярной, грубоволокнистой костной и пластинчатой тканей. Имеющиеся в литературе данные дополнены фактическими значениями их площадей на разные сутки после моделирования перелома с сохранением функциональной нагрузки на конечности, их процентными отношениями к общей площади формирующегося регенерата и динамикой их изменений от одного срока к другому.

About the authors

Vitaliy Morozov

Belgorod National Research University (Belgorod, Russian Federation)

Author for correspondence.
Email: vitaliyymorozov85@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1169-4285

Russian Federation, 308015, Belgorod, Pobedy Str., 85

Viktoria Pecherskaia

Yakovlevskaya Central District Hospital (Belgorod Region, Stroitel, Russian Federation)

Email: konshina.viktory@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1615-4904

Russian Federation, 309070, Belgorod region, Stroitel, Lenin st., 26

Elena Morozova

Belgorod National Research University (Belgorod, Russian Federation)

Email: tiger2910@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-6117-080X

Russian Federation, 308015, Belgorod, Pobedy Str., 85

Ekaterina Novik

Belgorod National Research University (Belgorod, Russian Federation)

Email: sidekser@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-7489-0260

Russian Federation, 308015, Belgorod, Pobedy Str., 85

References

Supplementary files