Donor-specific production of cytokines by blood cells under the influence of immunomodulators: New aspects of a personalized approach in medicine

Larisa T. Volova; Волова Лариса Теодоровна; Natalya K. Osina; Осина Наталья Константиновна; Sergei I. Kuznetsov; Кузнецов Сергей Иванович; Oksana A. Gusyakova; Гусякова Оксана Анатольевна; Denis G. Alekseev; Алексеев Денис Георгиевич; Evgenii I. Pugachev; Пугачев Евгений Игоревич; Sergei A. Goncharenko; Гончаренко Сергей Анатольевич

doi:10.35693/2500-1388-2022-7-4-250-257

Донор-специфичная продукция цитокинов клетками крови под влиянием иммуномодуляторов: новые аспекты персонифицированного подхода в медицине

Авторы: Волова Л.Т.¹, Осина Н.К.¹, Кузнецов С.И.¹, Гусякова О.А.¹, Алексеев Д.Г.¹, Пугачев Е.И.¹, Гончаренко С.А.²
Учреждения:
1. ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России
2. ФГБОУ ВО «Самарский государственный технический университет»
Выпуск: Том 7, № 4 (2022)
Страницы: 250-257
Раздел: Общественное здоровье, организация и социология здравоохранения
Статья опубликована: 02.12.2022
URL: https://innoscience.ru/2500-1388/article/view/111892
DOI: https://doi.org/10.35693/2500-1388-2022-7-4-250-257
ID: 111892

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель – изучить индуцированную иммуномодуляторами индивидуальную продукцию цитокинов клетками – мононуклеарами периферической крови и оценить потенциал использования данного подхода в качестве универсальной клеточной тест-системы в персонифицированной медицине.

Материал и методы. Мононуклеары, изолированные из перифирической крови доноров, культивировали in vitro в присутствии иммуномодуляторов имунофан и полиоксидоний. После инкубации был проведен иммуноферментный анализ культуральной среды на присутствие провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8/CXCL8, МСР-1/CCL2 и IFN-α.

Результаты. По итогам проведенного эксперимента было продемонстрировано отсутствие спонтанной или индуцированной иммуномодуляторами продукции IFN-α РВМС-клетками. Эти данные соответствуют сведениям, представленным ранее в медицинской литературе. Также наблюдали четко выраженный ингибирующий эффект обоих иммуномодуляторов на продукцию РВМС-клетками цитокинов МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8, наряду с индивидуальной вариабельностью их продукции и накопительным эффектом продукции во времени.

Выводы. Выявленные посредством in vitro скрининга особенности продукции провоспалительных цитокинов в питательную среду РВМС-клетками в присутствии иммуномодуляторов могут быть использованы при создании универсальных клеточных тест-систем in vitro для персонифицированной диагностики ряда социально значимых заболеваний воспалительного и аутоиммунного характера.

Ключевые слова

клеточная биология, мононуклеарные клетки периферической крови, цитокины, иммуномодуляторы, персонифицированная медицина

Полный текст

РВМС – Peripheral Blood Mononuclear Cells – мононуклеарные клетки периферической крови; NK-клетки – клетки натуральные киллеры; E. coli LPS / LPS – бактериальный липосахарид кишечной палочки; IL-8/CXCL8 – интерлейкин 8; IL-6 – интерлейкин 6; TNF-α – фактор некроза опухоли-альфа; IFN-α – интерферон-альфа; СОКСПК – Самарская областная клиническая станция переливания крови; MCP-1/CCL2 – моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1.

ВВЕДЕНИЕ

Иммунная система играет решающую роль в распознавании как чужеродных агентов, так и патологических изменений собственных клеток. Контроль со стороны иммунной системы выражается в том числе в изменении баланса цитокинов крови, что широко и активно используют при диагностике аутоиммунных и воспалительных социально значимых заболеваний. Однако индивидуальный уровень цитокинов в крови зависит от многих факторов, напрямую не связанных с заболеванием. Сюда можно отнести гипо- (в т.ч. генетически) и гипериммунный статус, возраст и пол пациента, а также время года, окружающую среду и другие факторы [1].

Поэтому при проведении диагностики заболеваний воспалительного и аутоиммунного характера, мониторинге их течения и ответа на лечение более корректно использовать модель, базирующуюся на изучении особенностей секреции цитокинов стимулированными мононуклеарами периферической крови (Peripheral Blood Mononuclear Cells, далее – PBMC). PBMC-клетки легко могут быть выделены из периферической крови с помощью фиколла и представляют собой мононуклеары, состоящие в основном из лимфоцитов (Т-клеток, В-клеток, NK-клеток) и моноцитов. Градиентное центрифугирование в фиколле позволяет отделить их от безъядерных (эритроциты и тромбоциты) и полиморфноядерных (нейтрофилы, базофилы и эозинофилы) клеток.

Ряд исследований последних лет продемонстрировал, что стимулированные РВМС-клетки от доноров с патологией вырабатывают иной профиль цитокинов/хемокинов, нежели стимулированные РВМС от здоровых доноров [2–4]. В частности, РВМС-клетки от здоровых доноров, стимулированные бактериальным липосахаридом (E. coli LPS / LPS), вырабатывали больше интерлейкина 8 (IL-8) и меньше интерлейкина 6 (IL-6) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), чем LPS-стимулированные РВМС-клетки от больных с хроническим периодонтитом [2].

В рамках разработки персонифицированных подходов в диагностике и прогнозировании различных патологий было проведено исследование (включено 500 участников) по изучению возможного влияния микрофлоры кишечника на выработку цитокинов РВМС-клетками, которые получали от здоровых доноров. Результаты исследования показали наличие корреляции между донор-специфичной вариабельностью индукции выработки цитокинов при воздействии на РВМС различными патогенами – представителями микрофлоры кишечника. Также была продемонстрирована высокая индивидуальная вариабельность интенсивности продукции цитокинов при индукции РВМС-клеток одним и тем же видом патогена. В то же время патоген-специфичной стимуляции выработки разных видов воспалительных цитокинов РВМС-клетками выявлено не было [5].

Также исследователи обнаружили корреляцию между тяжестью протекания сепсиса с развитием неблагоприятного исхода и сниженной продукцией TNF-α LPS-стимулированными РВМС-клетками у этих пациентов [6]. С учетом результатов данного исследования был предложен персонифицированный подход к прогнозированию сепсиса, а именно: течение патологического процесса потенциально может быть более благоприятным, если РВМС-клетки таких пациентов в ответ на стимуляцию LPS будут продуцировать >250 пг/мл TNF-α [3]. Использование подобной прогнозной модели позволит врачам подбирать наиболее эффективную персонифицированную схему лечения.

В рамках проведения научно-исследовательских работ по разработке новых методов прогнозирования развития и течения социально значимых воспалительных и аутоиммунных заболеваний мы предположили, что РВМС-клетки могут быть использованы и в качестве персонифицированной клеточной тест-системы для выявления индивидуальной картины продукции цитокинов под влиянием различных иммуномодуляторов. Иммуномодуляторы представляют собой лекарственные препараты, способные оказывать стимулирующее или ингибирующее воздействие на гуморальное и/или клеточное звено иммунитета в зависимости от его текущего функционального состояния. Для проверки гипотезы мы провели исследование по изучению влияния иммуномодуляторов полиоксидония и имунофана на продукцию воспалительных цитокинов РВМС-клетками, культивируемыми in vitro.

Полиоксидоний (сополимер N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиния бромида) с молекулярной массой 80 кДа является представителем препаратов с иммуномодулирующим действием, обусловленным стимуляцией антитело-образования, а также воздействием на фагоцитирующие и NK-клетки. В определенных дозах полиоксидоний обладает способностью модулировать синтез цитокинов IL-1β, IL-6, TNF-α. При этом он ведет себя как истинный иммуномодулятор, усиливая образование TNF-α у лиц с исходно пониженным синтезом цитокинов, и не оказывает влияния или даже несколько понижает продукцию TNF-α у лиц с исходно повышенной интенсивностью синтеза цитокинов [7]. Полиоксидоний используют как адъювант в составе противогриппозных вакцин. Установлено, что адъювантная вакцина, содержащая препарат, более активно стимулирует выработку цитокинов Th-1 (IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-1β, TNF-α) [8]. Как адъювант иммунотерапии рака молочной железы, полиоксидоний способствует регрессу патологических изменений у 6 из 20 пациенток, включая эпизоды с трижды негативным вариантом заболевания [9].

Полиоксидоний обладает также антиоксидантным, детоксицирующим, мембранопротекторным и хелатирующим эффектами [10]. Его антиоксидантные свойства связаны со способностью к перехвату в водной среде активных форм кислорода, супероксидного аниона, перекиси водорода, гидроксильного радикала; также к снижению концентрации каталитически активного двухвалентного железа, ингибированию перекисного окисления липидов, подавлению спонтанной и индуцированной люминол- и люцегенинзависимой хемилюминесценции. В эксперименте при совместном введении полиоксидония и сульфата меди первый обеспечивает 100% защиту животных от ядовитого действия второго при 100% гибели контрольных животных [7]. Мембранопротекторные свойства препарата обеспечивают защиту клеток от повреждающего воздействия ряда токсических веществ. Сочетание иммуномодулирующих, антиоксидантных и детоксицирующих свойств делает полиоксидоний одним из эффективных иммуномодулирующих средств с противовоспалительной активностью [11–15].

Имунофан (синтетический гексапептид аргинил-альфа-аспартил-лизил-валин-тирозил-аргинин) с молекулярной массой 836Да обладает иммунорегулирующим, детоксикационным, гепатопротективным действием и находит применение при лечении ряда заболеваний [16]. Препарат стимулирует процессы созревания Т-лимфоцитов, кооперативные взаимодействия CD4+-клеток и клеток костного мозга, повышает активность NK-клеток и кислородзависимой системы бактерицидности нейтрофилов, активирует ранние этапы антителогенеза, синтез иммуноглобулинов классов M, G, A; стимулирует нарушенную продукцию тимических гормонов, в том числе сывороточного тимического фактора, а также интерлейкина-2 (IL-2), интерферона-α (IFN-α) [17]. Имунофан применяют в качестве адъюванта базисной противоязвенной терапии [18], как средство иммунокоррекции в комплексном лечении онкобольных, которое снижает вероятность возникновения местных и системных осложнений во время лучевой терапии и тем самым помогает обеспечить непрерывность лечения [16, 19]. Была показана эффективность имунофана при нарушениях иммунного статуса у пациентов с хронической интоксикацией фосфороорганическими соединениями: препарат, вводимый в течение 5 дней, способствовал восстановлению клеточного и гуморального звеньев иммунитета и регулировал содержание цитокинов в крови пациентов [20].

Воздействуя иммуномодуляторами на PBMC-клетки и оценивая ответную индуцированную выработку цитокинов, варьирующую в зависимости от особенностей организма пациента, можно будет подобрать максимально эффективный индивидуальный план лечения, что в полной мере соответствует критерию персонифицированного подхода в медицине.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить индуцированную иммуномодуляторами индивидуальную продукцию цитокинов PBMC-клетками и оценить потенциал использования данного подхода в качестве универсальной клеточной тест-системы в персонифицированной медицине.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования послужили образцы крови потенциально здоровых лиц, а именно доноров крови из реестра Самарской областной клинической станции переливания крови (далее – ГБУЗ «СОКСПК»). В рамках проведения исследования была оформлена разрешительная документация Биоэтического комитета СамГМУ (протокол №215 от 20.01.2021 г.). Общее количество участников исследования составило 7 человек. В 100% эпизодов это были лица мужского пола, средний возраст которых составил 31,4±4,0 года. Отбор участников исследования из реестра доноров ГБУЗ «СОКСПК» производили рандомизированно. Каждый участник подписал добровольное информированное согласие на обработку персональных данных и передачу сведений, составляющих врачебную тайну, а также на передачу биологического материала (венозной крови) в рамках проводимого исследования. Венозную кровь забирали в вакуумные пробирки с гепарином натрия (Welhai Hongyu, Medical devices Co., Ltd., Китай) из вен в области локтевой ямки. Процедуру проводили утром, в 09.00 часов, натощак.

Дизайн исследования. В ходе работы изучали продукцию ряда цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8 и IFN-α) РВМС-клетками, полученными от здоровых доноров и стимулированными иммуномодуляторами имунофан и полиоксидоний. Для этого проводили выделение РВМС-клеток, их культивирование, добавление иммуномодуляторов с последующей оценкой продукции цитокинов методом ИФА. Было проведено три серии экспериментов.

Первая серия экспериментов позволяла оценить, какие из анализируемых цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8, IFN-α) продуцируются РВМС-клетками в условиях in vitro. Для этой цели клетки из цельной крови от 5 доноров были объединены в один лот. Во второй серии экспериментов оценивали индивидуальную картину индуцированной иммуномодуляторами экспрессии цитокинов, поэтому использовали РВМС-клетки, выделенные от индивидуальных доноров (№72219 (30 лет) и №16427 (32 года)), которые не объединяли в один лот. Третья серия экспериментов была необходима для подтверждения или опровержения феномена накопительного эффекта продукции цитокинов во времени.

Полученные по итогам исследования данные сводили в таблицы с расчетом средних арифметических значений и стандартных ошибок средних арифметических значений. Вычисление достоверности различий между двумя средними арифметическими значениями производили с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверным при р≤0,05.

Выделение РВМС-клеток из крови доноров. Выделение РВМС-клеток из периферической гепаринизированной венозной крови доноров осуществляли методом седиментации в градиенте плотности (ρ=1,077 г/см³) фиколл-верографин (ООО «БиолоТ», Россия), по методике A. Boyum, 1968 г. [21]. После градиентного центрифугирования клетки дважды отмывали в стерильной питательной среде RPMI-1640 с L-глутамином (Sigma-Aldrich, США). Для проведения экспериментов РВМС-клетки сохраняли в среде RPMI-1640 с L-глутамином с добавлением 80 мкг/мл гентамицина (ОАО «Дальхимфарм», Россия), 50 Ед/мл пенициллина (ООО «БиолоТ», Россия) и 50 мкг/мл стрептомицина (ООО «БиолоТ», Россия). Жизнеспособность клеток определяли с помощью окрашивания трипановым синим (ООО «БиолоТ», Россия).

Стимуляция РВМС-клеток иммуномодуляторами. Для изучения индуцированной продукции цитокинов РВМС-клетками мы использовали официальные лекарственные формы следующих иммуномодуляторов: полиоксидоний в форме раствора, с содержанием активного вещества 6 мг/мл (НПО «Петровакс Фарм», Россия); имунофан в форме раствора, с содержанием активного вещества 45 мкг/мл (ООО НПП «Бионокс», Россия).

Официнальные формы обоих иммуномодуляторов путем разведения переводили в экстемпоральные растворы следующих концентраций (по активному веществу): 50, 25 и 12.5 нг/мл для первой серии экспериментов; 200 нг/мл для второй и третьей серии экспериментов.

В каждой серии экспериментов питательную среду с содержанием РВМС 2×10⁶ клеток/мл, помещали в лунки 96-луночного планшета (TPP, Швейцария), в объеме 100 мкл на лунку. Итоговое содержание РВМС в лунках составляло 2×10⁵ клеток/лунку. В первой серии экспериментов РВМС-клетками объединенного лота заполняли 2 ряда лунок по 3 лунки в каждом ряду. В лунки первого ряда добавляли по 100 мкл экстемпорального раствора полиоксидония в концентрациях 50, 25 и 12.5 нг/мл, в лунки второго ряда – 100 мкл экстемпорального раствора имунофана в концентрациях 50, 25 и 12.5 нг/мл. Итоговое содержание иммуномодуляторов в лунках каждого ряда составляло 25, 12.5 и 6.25 нг/лунку.

Во второй и третьей сериях экспериментов использовали РВМС-клетки отдельных доноров. Для каждого донора заполняли 2 ряда лунок по 1 лунке в каждом ряду. В лунку первого ряда к РВМС добавляли 100 мкл экстемпорального раствора иммуномодулятора полиоксидония в концентрации 200 нг/мл; в лунку второго ряда – 100 мкл экстемпорального раствора иммуномодулятора имунофана в концентрации 200 нг/мл. Итоговое содержание иммуномодуляторов в лунках составляло 100 нг/лунку.

В первой серии экспериментов иммуномодуляторы добавляли в лунки планшета со свежевыделенными РВМС-клетками в питательной среде. Далее осуществляли 20-часовую инкубацию планшета в СО₂-инкубаторе (Binder, Германия) при 37°С и 5% СО₂. Во второй серии экспериментов планшет с РВМС-клетками в питательной среде первоначально инкубировали в СО₂-инкубаторе в течение 18 часов при 37°С и 5% СО₂, затем меняли питательную среду на свежую, добавляли в лунки иммуномодуляторы и снова помещали в СО₂-инкубатор на 20 часов при 37°С и 5% СО₂. В третьей серии экспериментов так же, как и во второй, производили первичное инкубирование планшета с РВМС-клетками в питательной среде в СО₂-инкубаторе в течение 18 часов при 37°С и 5% СО₂. Затем добавляли иммуномодуляторы в лунки, но без замены питательной среды на свежую и снова помещали в СО₂-инкубатор на 48 часов при 37°С и 5% СО₂.

Иммуноферментный анализ. После добавления иммуномодуляторов в лунки планшета к РВМС-клеткам с питательной средой и окончания инкубирования мы подвергали содержимое лунок иммуноферментному анализу (далее – ИФА) применительно ко всем сериям экспериментов. При этом процесс проведения ИФА полностью соответствовал описанному в инструкции, приложенной производителем (ООО «Вектор», РФ) к диагностическому набору. Чувствительность ИФА составляла 0.5; 2; 15 и 5 пг/мл для IL-6, IL-8, MCP-1 и IFN-α соответственно.

Методы статистической обработки результатов исследования. Данные по результатам исследования были сведены в таблицу и графики диаграмм с помощью программы Microsoft Excel. При этом вычисляли средние величины (М) и ошибки средних величин (m). Далее производили оценку достоверности средних величин, различий между средними величинами. С этой целью определяли экспериментальный критерий нормированного отклонения t_эксп для разности средней величины выборки и средних величин двух выборок. Затем сравнивали полученный экспериментальный критерий t_эксп с t_табл для доверительной вероятности Р=0.95. Если t_экспбыл больше либо равен t_табл, то считали, что средняя величина выборки достоверно отражает генеральную среднюю, или две выборки отличаются с вероятностью, большей либо равной 0.95 (значимость 95%, вероятность ошибки 5%).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В первой серии экспериментов анализ экспрессии РВМС-клетками цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8, IFN-α) в питательную среду показал следующее результаты. Спонтанная продукция цитокинов (т.е. без добавления иммуномодуляторов) РВМС-клетками была достаточно высокой: 500–3500 пг/мл (рисунок 1). При этом в количественном соотношении экспрессия IL-8/CXCL8 достоверно превышала экспрессию IL-6 и MCP-1/CCL2. Различия статистически значимы (р≤0.05) в обоих случаях. При добавлении иммуномодуляторов уровни продукции цитокинов IL-6, IL-8/CXCL8, МСР-1/CCL2 изменялись согласно динамике диаграмм на рисунке 1 с отражением достоверности различий между спонтанным (исходным) и индуцированными уровнями секреции цитокинов РВМС-клетками.

Рисунок 1. In vitro скрининг продукции цитокинов МСР-1/CCL2 (А), IL-6 (В), IL-8/CXCL8 (С) РВМС-клетками от 5 здоровых доноров (объединенный лот). / Figure 1. In vitro screening of cytokines MCP-1/CCL2 (A), IL-6 (B), IL-8/CXCL8 (C) production by PBMCs obtained from 5 healthy donors (joined lot).

В то же время результаты ИФА показали отсутствие экспрессии IFN-α РВМС-клетками как до, так и после добавления иммуномодуляторов. Показатели оптической плотности (далее – ОП) между образцами в лунках, содержащими питательную среду и РВМС-клетки, стимулированные иммуномодуляторами имунофан и полиоксидоний (в различных концентрациях), достоверно не отличались от значений показателей ОП в лунках с контрольной средой RPMI (бланк) или стандартной пробой с нулевой концентрацией IFN-α (0 пг/мл) (таблица 1). Различия статистически не значимы (р≥0,05). Поэтому оценку экспрессии IFN-α во второй и третьей сериях экспериментов не производили.

Таблица 1. In vitro скрининг продукции цитокина IFN-α РВМС-клетками / Table 1. In vitro screening of cytokine IFN-α production by PBMCs

№ п/п	Описание пробы	ОП
1	Среда RPMI только (бланк)	0,0149
2	0 нг/мл иммуномодуляторов	0,0117
3	Имунофан 6,25 нг/мл	0,0121
4	Имунофан 12,5 нг/мл	0,0154
5	Имунофан 25 нг/мл)	0,0116
6	Полиоксидоний 6,25 нг/мл	0,0136
7	Полиоксидоний 12,5 нг/мл	0,0166
8	Полиоксидоний 25 нг/мл	0,0114

Во второй серии экспериментов уровни спонтанной продукции цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8) были сопоставимы с таковыми в первой серии (рисунки 1–4). Различия между результатами первой и второй серий экспериментов по данному параметру статистически не значимы (р≥0.05) применительно ко всем трем анализируемым цитокинам. Количественное соотношение цитокинов при их спонтанной продукции во второй серии экспериментов было аналогичным таковому в первой серии. Экспрессия IL-8/CXCL8 (рисунок 3) достоверно превосходила экспрессию IL-6 (рисунок 4) и МСР-1/CCL2 (рисунок 2). Различия статистически значимы (р≤0.05) в обоих случаях.

Рисунок 2. Сравнение продукции МСР-1 РВМС-клетками от индивидуальных доноров №72219 (А) и №116427 (В) в ответ на стимуляцию иммуномодуляторами. / Figure 2. Comparison of MCP-1 production by PBMCs from individual donors No. 72219 (A) and No. 116427 (В) in response to stimulation with immunomodulators.

Рисунок 3. Сравнение продукции IL-8 РВМС-клетками от индивидуальных доноров №72219 (А) и №116427 (В) в ответ на стимуляцию иммуномодуляторами. / Figure 3. Comparison of IL-8 production by PBMCs from individual donors No. 72219 (A) and No. 116427 (В) in response to stimulation with immunomodulators.

В целом во второй серии экспериментов при сравнении спонтанной и индуцированной экспрессии цитокинов РВМС-клетками было выявлено достоверное ингибирующее влияние иммуномодуляторов (рисунок 4). Различия между спонтанной и индуцированной экспрессией в данной серии экспериментов статистически значимы применительно ко всем трем анализируемым цитокинам (р≤0.05).

Рисунок 4. Сравнение продукции IL-6 РВМС-клетками от индивидуальных доноров №72219 (А) и №116427 (В) в ответ на стимуляцию иммуномодуляторами. / Figure 4. Comparison of the IL-6 production by PBMCs from individual donors No. 72219 (A) and No. 116427 (В) in response to stimulation with immunomodulators.

Рисунок 5. Сравнение продукции МСР-1 в питательную среду РВМС-клетками донора №116427 с инкубацией в присутствии иммуномодуляторов в течение 20 и 48 часов. / Figure 5. Comparison of MCP-1 production into the breeding ground by PBMCs obtained from donor No. 116427 after incubation with immunomodulators during 20 and 48 hours.

Также мы наблюдали индивидуальные различия в продукции цитокинов РВМС-клетками доноров на фоне воздействия иммуномодуляторов (рисунки 2–4). При равных экспериментальных условиях продукция МСР-1 клетками донора 116427 оставалась неизменной после добавления иммуномодуляторов (рисунок 2Б). Различия между спонтанной и индуцированной экспрессией МСР-1 у данного донора статистически не значимы (р≥0.05). В аналогичной ситуации у донора 72219 наблюдали достоверный ингибирующий эффект иммуномодуляторов (рисунок 2А). Различия со спонтанной секрецией МСР-1 у донора 72219 статистически значимы (р≤0.05).

В плане продукции IL-8/CXCL8 у обоих доноров наблюдали ингибирующий эффект как от использования полиоксидония, так и от применения имунофана. Различия со спонтанной экспрессией в данном эпизоде статистически значимы (р≤0.05). Однако у донора 72219 различия между индуцированной и спонтанной экспрессией IL-8/CXCL8 носили достоверно (р≤0,05) более выраженный характер по сравнению с таковыми у донора 116427 (рисунок 3). По уровню продукции IL-6 также отмечали достоверный ингибирующий эффект у обоих доноров от применения как полиоксидония, так и имунофана. Различия со спонтанным уровнем экспрессии статистически значимы у обоих доноров (р≤0,05). Но в данном эпизоде степень выявленных различий была достоверно (р≤0,05) более значимой у донора 116427 (рисунок 4).

Как видно из рисунка 5, концентрация МСР-1 в питательной среде с РВМС-клетками была достоверно выше при инкубации с иммуномодуляторами в течение 48 часов. Различие аналогичным параметром при 20-часовой инкубации статистически значимо.

ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие биотехнологий в условиях форсирования персонифицированного подхода в медицине подразумевает особое внимание к возможности применения стимулированных клеток крови. В ответ на внешнюю стимуляцию эти клетки вырабатывают цитокины в донор-специфической манере и поэтому являются перспективным материалом для разработки универсальных клеточных тест-систем по диагностике социально значимых заболеваний воспалительного и аутоиммунного характера. В связи с этим мы провели пилотные эксперименты по оценке продукции ряда цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8 и IFN-α) РВМС-клетками, полученными от здоровых доноров и стимулированными иммуномодуляторами имунофан и полиоксидоний.

По итогам первой серии экспериментов наиболее отчетливо было продемонстрировано отсутствие спонтанной или индуцированной иммуномодуляторами продукции IFN-α. Эти данные соответствуют раннее опубликованным в литературе сведениям, в частности, о том, что полиоксидоний-стимулированные клетки крови не способны индуцировать синтез IFN-α, но обладают модулирующей активностью в плане продукции цитокинов: IL-1β, IL-6, TNFα [7]. Нами было показано, что имунофан также не стимулирует выработку IFN-α РВМС-клетками от здоровых доноров. В случае МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8 оценка их продукции РВМС-клетками от 5 здоровых доноров продемонстрировала количественно определяемую (достоверно выше барьера чувствительности ИФА) секрецию данных цитокинов в питательную среду.

В экспериментах с клетками индивидуальных доноров в большинстве случаев наблюдали четко выраженный ингибирующий эффект обоих иммуномодуляторов на продукцию цитокинов МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8. Данные цитокины принимают участие в патогенезе различных заболеваний: IL-6 – это многофункциональный цитокин, содержание которого в крови повышено на фоне острых и хронических форм воспаления и аутоиммунных процессов. Последние имеют место при таких социально значимых патологиях, как ревматоидный артрит, псориаз, болезнь Кастлемана и др. [22–24]. МСР-1/CCL2 и IL-8/CXCL8 являются мощными медиаторами воспаления, относящимися к группе хемокинов, основная функция которых состоит в стимуляции передвижения иммунных клеток к очагу воспаления [25–27]. Представленные в данном исследовании цитокины МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8 уже служат диагностическими маркерами некоторых нозологий, и их применение в диагностике вышеперечисленных социально значимых заболеваний несомненно растет с каждым годом [28–29]. Обнаружение индивидуальной вариабельности продукции цитокинов МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8 РВМС-клетками крови от разных доноров в ответ на стимуляцию иммуномодуляторами является важной предпосылкой для развития персонифицированных диагностических тестов с использованием клеток крови пациентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Первая серия экспериментов позволила оценить, какие из анализируемых цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8, IFN-α) продуцируются РВМС-клетками в питательную среду в условиях in vitro. Результаты этой серии указывают на отсутствие продукции IFN-α РВМС-клетками крови и на их способность продуцировать IL-6, IL-8/CXCL8, МСР-1/CCL2 при данных экспериментальных условиях. Существенный разброс в стандартных отклонениях значений в первой серии экспериментов, когда клетки от 5 доноров были объединены в один лот, вероятно, связан с донор-специфичной вариабельностью продукции отдельных цитокинов. Для подтверждения данной гипотезы мы провели вторую серию экспериментов.

Вторая серия экспериментов была проведена с РВМС-клетками, выделенными от индивидуальных доноров. Следует отметить, что в данной серии экспериментов РВМС были предварительно проинкубированы в бессывороточной среде в течение ночи и на следующий день, перед добавлением иммуномодуляторов, были отмыты от питательной среды. Таким образом, накопленные за ночь цитокины были удалены, что давало возможность после инкубации в течение 20 часов более точно оценить влияние иммуномодуляторов на синтез цитокинов. Данная серия экспериментов достоверно продемонстрировала индивидуальную вариабельность в продукции отдельных цитокинов и подтвердила нашу гипотезу.

Чтобы убедиться, что существует накопительный эффект продукции цитокинов во времени, была проведена третья серия экспериментов: к предварительно проинкубированным РВМС-клеткам донора 116427 были добавлены иммуномодуляторы без смены питательной среды с последующей инкубаций в течение 48 часов. Содержание цитокина МСР-1/CCL2 в данной серии экспериментов было достоверно (на порядок) выше, чем во второй серии, подтвердив наличие накопительного эффекта.

В целом проведенный in vitro скрининг продукции цитокинов в питательную среду РВМС-клетками в присутствии иммуномодуляторов имунофан и полиоксидоний продемонстрировал отсутствие продукции IFN-α наряду с индивидуальной вариабельностью продукции IL-6, IL-8/CXCL8, МСР-1/CCL2, что может быть использовано при создании универсальных клеточных тест-систем in vitro для персонифицированной диагностики ряда социально значимых заболеваний воспалительного и аутоиммунного характера.

Конфликт интересов: все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.