Donor-specific production of cytokines by blood cells under the influence of immunomodulators: New aspects of a personalized approach in medicine

Cover Page

Cite item

Abstract

Aim – to study the immunomodulator-induced individual cytokine production by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and to evaluate the potential of using this approach as a universal cellular test system in personalized medicine.

Material and methods. The peripheral blood mononuclear cells given by donors were cultured in vitro in the presence of immunomodulators Imunofan and Polyoxidonium. After incubation, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of the culture medium for the presence of pro-inflammatory cytokines IL-6, IL-8/CXCL8, MCP-1/CCL2, and IFN-α cytokines was performed.

Results. The results of the experiment have demonstrated the absence of spontaneous or immunomodulator-induced production of IFN-α by PBMCs. These data correspond to the information presented earlier in the scientific literature. We also observed a pronounced inhibitory effect of both immunomodulators on the production of cytokines MCP-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8 by PBMCs, along with the individual variability of their production and the cumulative effect of production over time.

Conclusion. The features of the production of pro-inflammatory cytokines by PBMCs into the medium in the presence of immunomodulators, revealed by the in vitro screening, can be used to develop universal in vitro cellular test systems for personalized diagnosis of a number of socially significant inflammatory and autoimmune diseases.

Full Text

РВМС – Peripheral Blood Mononuclear Cells – мононуклеарные клетки периферической крови; NK-клетки – клетки натуральные киллеры; E. coli LPS / LPS – бактериальный липосахарид кишечной палочки; IL-8/CXCL8 – интерлейкин 8; IL-6 – интерлейкин 6; TNF-α – фактор некроза опухоли-альфа; IFN-α – интерферон-альфа; СОКСПК – Самарская областная клиническая станция переливания крови; MCP-1/CCL2 – моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1.

ВВЕДЕНИЕ

Иммунная система играет решающую роль в распознавании как чужеродных агентов, так и патологических изменений собственных клеток. Контроль со стороны иммунной системы выражается в том числе в изменении баланса цитокинов крови, что широко и активно используют при диагностике аутоиммунных и воспалительных социально значимых заболеваний. Однако индивидуальный уровень цитокинов в крови зависит от многих факторов, напрямую не связанных с заболеванием. Сюда можно отнести гипо- (в т.ч. генетически) и гипериммунный статус, возраст и пол пациента, а также время года, окружающую среду и другие факторы [1].

Поэтому при проведении диагностики заболеваний воспалительного и аутоиммунного характера, мониторинге их течения и ответа на лечение более корректно использовать модель, базирующуюся на изучении особенностей секреции цитокинов стимулированными мононуклеарами периферической крови (Peripheral Blood Mononuclear Cells, далее – PBMC). PBMC-клетки легко могут быть выделены из периферической крови с помощью фиколла и представляют собой мононуклеары, состоящие в основном из лимфоцитов (Т-клеток, В-клеток, NK-клеток) и моноцитов. Градиентное центрифугирование в фиколле позволяет отделить их от безъядерных (эритроциты и тромбоциты) и полиморфноядерных (нейтрофилы, базофилы и эозинофилы) клеток.

Ряд исследований последних лет продемонстрировал, что стимулированные РВМС-клетки от доноров с патологией вырабатывают иной профиль цитокинов/хемокинов, нежели стимулированные РВМС от здоровых доноров [2–4]. В частности, РВМС-клетки от здоровых доноров, стимулированные бактериальным липосахаридом (E. coli LPS / LPS), вырабатывали больше интерлейкина 8 (IL-8) и меньше интерлейкина 6 (IL-6) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), чем LPS-стимулированные РВМС-клетки от больных с хроническим периодонтитом [2].

В рамках разработки персонифицированных подходов в диагностике и прогнозировании различных патологий было проведено исследование (включено 500 участников) по изучению возможного влияния микрофлоры кишечника на выработку цитокинов РВМС-клетками, которые получали от здоровых доноров. Результаты исследования показали наличие корреляции между донор-специфичной вариабельностью индукции выработки цитокинов при воздействии на РВМС различными патогенами – представителями микрофлоры кишечника. Также была продемонстрирована высокая индивидуальная вариабельность интенсивности продукции цитокинов при индукции РВМС-клеток одним и тем же видом патогена. В то же время патоген-специфичной стимуляции выработки разных видов воспалительных цитокинов РВМС-клетками выявлено не было [5].

Также исследователи обнаружили корреляцию между тяжестью протекания сепсиса с развитием неблагоприятного исхода и сниженной продукцией TNF-α LPS-стимулированными РВМС-клетками у этих пациентов [6]. С учетом результатов данного исследования был предложен персонифицированный подход к прогнозированию сепсиса, а именно: течение патологического процесса потенциально может быть более благоприятным, если РВМС-клетки таких пациентов в ответ на стимуляцию LPS будут продуцировать >250 пг/мл TNF-α [3]. Использование подобной прогнозной модели позволит врачам подбирать наиболее эффективную персонифицированную схему лечения.

В рамках проведения научно-исследовательских работ по разработке новых методов прогнозирования развития и течения социально значимых воспалительных и аутоиммунных заболеваний мы предположили, что РВМС-клетки могут быть использованы и в качестве персонифицированной клеточной тест-системы для выявления индивидуальной картины продукции цитокинов под влиянием различных иммуномодуляторов. Иммуномодуляторы представляют собой лекарственные препараты, способные оказывать стимулирующее или ингибирующее воздействие на гуморальное и/или клеточное звено иммунитета в зависимости от его текущего функционального состояния. Для проверки гипотезы мы провели исследование по изучению влияния иммуномодуляторов полиоксидония и имунофана на продукцию воспалительных цитокинов РВМС-клетками, культивируемыми in vitro.

Полиоксидоний (сополимер N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиния бромида) с молекулярной массой 80 кДа является представителем препаратов с иммуномодулирующим действием, обусловленным стимуляцией антитело-образования, а также воздействием на фагоцитирующие и NK-клетки. В определенных дозах полиоксидоний обладает способностью модулировать синтез цитокинов IL-1β, IL-6, TNF-α. При этом он ведет себя как истинный иммуномодулятор, усиливая образование TNF-α у лиц с исходно пониженным синтезом цитокинов, и не оказывает влияния или даже несколько понижает продукцию TNF-α у лиц с исходно повышенной интенсивностью синтеза цитокинов [7]. Полиоксидоний используют как адъювант в составе противогриппозных вакцин. Установлено, что адъювантная вакцина, содержащая препарат, более активно стимулирует выработку цитокинов Th-1 (IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-1β, TNF-α) [8]. Как адъювант иммунотерапии рака молочной железы, полиоксидоний способствует регрессу патологических изменений у 6 из 20 пациенток, включая эпизоды с трижды негативным вариантом заболевания [9].

Полиоксидоний обладает также антиоксидантным, детоксицирующим, мембранопротекторным и хелатирующим эффектами [10]. Его антиоксидантные свойства связаны со способностью к перехвату в водной среде активных форм кислорода, супероксидного аниона, перекиси водорода, гидроксильного радикала; также к снижению концентрации каталитически активного двухвалентного железа, ингибированию перекисного окисления липидов, подавлению спонтанной и индуцированной люминол- и люцегенинзависимой хемилюминесценции. В эксперименте при совместном введении полиоксидония и сульфата меди первый обеспечивает 100% защиту животных от ядовитого действия второго при 100% гибели контрольных животных [7]. Мембранопротекторные свойства препарата обеспечивают защиту клеток от повреждающего воздействия ряда токсических веществ. Сочетание иммуномодулирующих, антиоксидантных и детоксицирующих свойств делает полиоксидоний одним из эффективных иммуномодулирующих средств с противовоспалительной активностью [11–15].

Имунофан (синтетический гексапептид аргинил-альфа-аспартил-лизил-валин-тирозил-аргинин) с молекулярной массой 836Да обладает иммунорегулирующим, детоксикационным, гепатопротективным действием и находит применение при лечении ряда заболеваний [16]. Препарат стимулирует процессы созревания Т-лимфоцитов, кооперативные взаимодействия CD4+-клеток и клеток костного мозга, повышает активность NK-клеток и кислородзависимой системы бактерицидности нейтрофилов, активирует ранние этапы антителогенеза, синтез иммуноглобулинов классов M, G, A; стимулирует нарушенную продукцию тимических гормонов, в том числе сывороточного тимического фактора, а также интерлейкина-2 (IL-2), интерферона-α (IFN-α) [17]. Имунофан применяют в качестве адъюванта базисной противоязвенной терапии [18], как средство иммунокоррекции в комплексном лечении онкобольных, которое снижает вероятность возникновения местных и системных осложнений во время лучевой терапии и тем самым помогает обеспечить непрерывность лечения [16, 19]. Была показана эффективность имунофана при нарушениях иммунного статуса у пациентов с хронической интоксикацией фосфороорганическими соединениями: препарат, вводимый в течение 5 дней, способствовал восстановлению клеточного и гуморального звеньев иммунитета и регулировал содержание цитокинов в крови пациентов [20].

Воздействуя иммуномодуляторами на PBMC-клетки и оценивая ответную индуцированную выработку цитокинов, варьирующую в зависимости от особенностей организма пациента, можно будет подобрать максимально эффективный индивидуальный план лечения, что в полной мере соответствует критерию персонифицированного подхода в медицине.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить индуцированную иммуномодуляторами индивидуальную продукцию цитокинов PBMC-клетками и оценить потенциал использования данного подхода в качестве универсальной клеточной тест-системы в персонифицированной медицине.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования послужили образцы крови потенциально здоровых лиц, а именно доноров крови из реестра Самарской областной клинической станции переливания крови (далее – ГБУЗ «СОКСПК»). В рамках проведения исследования была оформлена разрешительная документация Биоэтического комитета СамГМУ (протокол №215 от 20.01.2021 г.). Общее количество участников исследования составило 7 человек. В 100% эпизодов это были лица мужского пола, средний возраст которых составил 31,4±4,0 года. Отбор участников исследования из реестра доноров ГБУЗ «СОКСПК» производили рандомизированно. Каждый участник подписал добровольное информированное согласие на обработку персональных данных и передачу сведений, составляющих врачебную тайну, а также на передачу биологического материала (венозной крови) в рамках проводимого исследования. Венозную кровь забирали в вакуумные пробирки с гепарином натрия (Welhai Hongyu, Medical devices Co., Ltd., Китай) из вен в области локтевой ямки. Процедуру проводили утром, в 09.00 часов, натощак.

Дизайн исследования. В ходе работы изучали продукцию ряда цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8 и IFN-α) РВМС-клетками, полученными от здоровых доноров и стимулированными иммуномодуляторами имунофан и полиоксидоний. Для этого проводили выделение РВМС-клеток, их культивирование, добавление иммуномодуляторов с последующей оценкой продукции цитокинов методом ИФА. Было проведено три серии экспериментов.

Первая серия экспериментов позволяла оценить, какие из анализируемых цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8, IFN-α) продуцируются РВМС-клетками в условиях in vitro. Для этой цели клетки из цельной крови от 5 доноров были объединены в один лот. Во второй серии экспериментов оценивали индивидуальную картину индуцированной иммуномодуляторами экспрессии цитокинов, поэтому использовали РВМС-клетки, выделенные от индивидуальных доноров (№72219 (30 лет) и №16427 (32 года)), которые не объединяли в один лот. Третья серия экспериментов была необходима для подтверждения или опровержения феномена накопительного эффекта продукции цитокинов во времени.

Полученные по итогам исследования данные сводили в таблицы с расчетом средних арифметических значений и стандартных ошибок средних арифметических значений. Вычисление достоверности различий между двумя средними арифметическими значениями производили с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверным при р≤0,05.

Выделение РВМС-клеток из крови доноров. Выделение РВМС-клеток из периферической гепаринизированной венозной крови доноров осуществляли методом седиментации в градиенте плотности (ρ=1,077 г/см3) фиколл-верографин (ООО «БиолоТ», Россия), по методике A. Boyum, 1968 г. [21]. После градиентного центрифугирования клетки дважды отмывали в стерильной питательной среде RPMI-1640 с L-глутамином (Sigma-Aldrich, США). Для проведения экспериментов РВМС-клетки сохраняли в среде RPMI-1640 с L-глутамином с добавлением 80 мкг/мл гентамицина (ОАО «Дальхимфарм», Россия), 50 Ед/мл пенициллина (ООО «БиолоТ», Россия) и 50 мкг/мл стрептомицина (ООО «БиолоТ», Россия). Жизнеспособность клеток определяли с помощью окрашивания трипановым синим (ООО «БиолоТ», Россия).

Стимуляция РВМС-клеток иммуномодуляторами. Для изучения индуцированной продукции цитокинов РВМС-клетками мы использовали официальные лекарственные формы следующих иммуномодуляторов: полиоксидоний в форме раствора, с содержанием активного вещества 6 мг/мл (НПО «Петровакс Фарм», Россия); имунофан в форме раствора, с содержанием активного вещества 45 мкг/мл (ООО НПП «Бионокс», Россия).

Официнальные формы обоих иммуномодуляторов путем разведения переводили в экстемпоральные растворы следующих концентраций (по активному веществу): 50, 25 и 12.5 нг/мл для первой серии экспериментов; 200 нг/мл для второй и третьей серии экспериментов.

В каждой серии экспериментов питательную среду с содержанием РВМС 2×106 клеток/мл, помещали в лунки 96-луночного планшета (TPP, Швейцария), в объеме 100 мкл на лунку. Итоговое содержание РВМС в лунках составляло 2×105 клеток/лунку. В первой серии экспериментов РВМС-клетками объединенного лота заполняли 2 ряда лунок по 3 лунки в каждом ряду. В лунки первого ряда добавляли по 100 мкл экстемпорального раствора полиоксидония в концентрациях 50, 25 и 12.5 нг/мл, в лунки второго ряда – 100 мкл экстемпорального раствора имунофана в концентрациях 50, 25 и 12.5 нг/мл. Итоговое содержание иммуномодуляторов в лунках каждого ряда составляло 25, 12.5 и 6.25 нг/лунку.

Во второй и третьей сериях экспериментов использовали РВМС-клетки отдельных доноров. Для каждого донора заполняли 2 ряда лунок по 1 лунке в каждом ряду. В лунку первого ряда к РВМС добавляли 100 мкл экстемпорального раствора иммуномодулятора полиоксидония в концентрации 200 нг/мл; в лунку второго ряда – 100 мкл экстемпорального раствора иммуномодулятора имунофана в концентрации 200 нг/мл. Итоговое содержание иммуномодуляторов в лунках составляло 100 нг/лунку.

В первой серии экспериментов иммуномодуляторы добавляли в лунки планшета со свежевыделенными РВМС-клетками в питательной среде. Далее осуществляли 20-часовую инкубацию планшета в СО2-инкубаторе (Binder, Германия) при 37°С и 5% СО2. Во второй серии экспериментов планшет с РВМС-клетками в питательной среде первоначально инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 18 часов при 37°С и 5% СО2, затем меняли питательную среду на свежую, добавляли в лунки иммуномодуляторы и снова помещали в СО2-инкубатор на 20 часов при 37°С и 5% СО2. В третьей серии экспериментов так же, как и во второй, производили первичное инкубирование планшета с РВМС-клетками в питательной среде в СО2-инкубаторе в течение 18 часов при 37°С и 5% СО2. Затем добавляли иммуномодуляторы в лунки, но без замены питательной среды на свежую и снова помещали в СО2-инкубатор на 48 часов при 37°С и 5% СО2.

Иммуноферментный анализ. После добавления иммуномодуляторов в лунки планшета к РВМС-клеткам с питательной средой и окончания инкубирования мы подвергали содержимое лунок иммуноферментному анализу (далее – ИФА) применительно ко всем сериям экспериментов. При этом процесс проведения ИФА полностью соответствовал описанному в инструкции, приложенной производителем (ООО «Вектор», РФ) к диагностическому набору. Чувствительность ИФА составляла 0.5; 2; 15 и 5 пг/мл для IL-6, IL-8, MCP-1 и IFN-α соответственно.

Методы статистической обработки результатов исследования. Данные по результатам исследования были сведены в таблицу и графики диаграмм с помощью программы Microsoft Excel. При этом вычисляли средние величины (М) и ошибки средних величин (m). Далее производили оценку достоверности средних величин, различий между средними величинами. С этой целью определяли экспериментальный критерий нормированного отклонения tэксп для разности средней величины выборки и средних величин двух выборок. Затем сравнивали полученный экспериментальный критерий tэксп с tтабл для доверительной вероятности Р=0.95. Если tэксп был больше либо равен tтабл, то считали, что средняя величина выборки достоверно отражает генеральную среднюю, или две выборки отличаются с вероятностью, большей либо равной 0.95 (значимость 95%, вероятность ошибки 5%).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В первой серии экспериментов анализ экспрессии РВМС-клетками цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8, IFN-α) в питательную среду показал следующее результаты. Спонтанная продукция цитокинов (т.е. без добавления иммуномодуляторов) РВМС-клетками была достаточно высокой: 500–3500 пг/мл (рисунок 1). При этом в количественном соотношении экспрессия IL-8/CXCL8 достоверно превышала экспрессию IL-6 и MCP-1/CCL2. Различия статистически значимы (р≤0.05) в обоих случаях. При добавлении иммуномодуляторов уровни продукции цитокинов IL-6, IL-8/CXCL8, МСР-1/CCL2 изменялись согласно динамике диаграмм на рисунке 1 с отражением достоверности различий между спонтанным (исходным) и индуцированными уровнями секреции цитокинов РВМС-клетками.

 

Рисунок 1. In vitro скрининг продукции цитокинов МСР-1/CCL2 (А), IL-6 (В), IL-8/CXCL8 (С) РВМС-клетками от 5 здоровых доноров (объединенный лот). / Figure 1. In vitro screening of cytokines MCP-1/CCL2 (A), IL-6 (B), IL-8/CXCL8 (C) production by PBMCs obtained from 5 healthy donors (joined lot).

 

В то же время результаты ИФА показали отсутствие экспрессии IFN-α РВМС-клетками как до, так и после добавления иммуномодуляторов. Показатели оптической плотности (далее – ОП) между образцами в лунках, содержащими питательную среду и РВМС-клетки, стимулированные иммуномодуляторами имунофан и полиоксидоний (в различных концентрациях), достоверно не отличались от значений показателей ОП в лунках с контрольной средой RPMI (бланк) или стандартной пробой с нулевой концентрацией IFN-α (0 пг/мл) (таблица 1). Различия статистически не значимы (р≥0,05). Поэтому оценку экспрессии IFN-α во второй и третьей сериях экспериментов не производили.

 

Таблица 1. In vitro скрининг продукции цитокина IFN-α РВМС-клетками / Table 1. In vitro screening of cytokine IFN-α production by PBMCs

№ п/п

Описание пробы

ОП

1

Среда RPMI только (бланк)

0,0149

2

0 нг/мл иммуномодуляторов

0,0117

3

Имунофан 6,25 нг/мл

0,0121

4

Имунофан 12,5 нг/мл

0,0154

5

Имунофан 25 нг/мл)

0,0116

6

Полиоксидоний 6,25 нг/мл

0,0136

7

Полиоксидоний 12,5 нг/мл

0,0166

8

Полиоксидоний 25 нг/мл

0,0114

 

Во второй серии экспериментов уровни спонтанной продукции цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8) были сопоставимы с таковыми в первой серии (рисунки 1–4). Различия между результатами первой и второй серий экспериментов по данному параметру статистически не значимы (р≥0.05) применительно ко всем трем анализируемым цитокинам. Количественное соотношение цитокинов при их спонтанной продукции во второй серии экспериментов было аналогичным таковому в первой серии. Экспрессия IL-8/CXCL8 (рисунок 3) достоверно превосходила экспрессию IL-6 (рисунок 4) и МСР-1/CCL2 (рисунок 2). Различия статистически значимы (р≤0.05) в обоих случаях.

 

Рисунок 2. Сравнение продукции МСР-1 РВМС-клетками от индивидуальных доноров №72219 (А) и №116427 (В) в ответ на стимуляцию иммуномодуляторами. / Figure 2. Comparison of MCP-1 production by PBMCs from individual donors No. 72219 (A) and No. 116427 (В) in response to stimulation with immunomodulators.

 

Рисунок 3. Сравнение продукции IL-8 РВМС-клетками от индивидуальных доноров №72219 (А) и №116427 (В) в ответ на стимуляцию иммуномодуляторами. / Figure 3. Comparison of IL-8 production by PBMCs from individual donors No. 72219 (A) and No. 116427 (В) in response to stimulation with immunomodulators.

 

В целом во второй серии экспериментов при сравнении спонтанной и индуцированной экспрессии цитокинов РВМС-клетками было выявлено достоверное ингибирующее влияние иммуномодуляторов (рисунок 4). Различия между спонтанной и индуцированной экспрессией в данной серии экспериментов статистически значимы применительно ко всем трем анализируемым цитокинам (р≤0.05).

 

Рисунок 4. Сравнение продукции IL-6 РВМС-клетками от индивидуальных доноров №72219 (А) и №116427 (В) в ответ на стимуляцию иммуномодуляторами. / Figure 4. Comparison of the IL-6 production by PBMCs from individual donors No. 72219 (A) and No. 116427 (В) in response to stimulation with immunomodulators.

 

Рисунок 5. Сравнение продукции МСР-1 в питательную среду РВМС-клетками донора №116427 с инкубацией в присутствии иммуномодуляторов в течение 20 и 48 часов. / Figure 5. Comparison of MCP-1 production into the breeding ground by PBMCs obtained from donor No. 116427 after incubation with immunomodulators during 20 and 48 hours.

 

Также мы наблюдали индивидуальные различия в продукции цитокинов РВМС-клетками доноров на фоне воздействия иммуномодуляторов (рисунки 2–4). При равных экспериментальных условиях продукция МСР-1 клетками донора 116427 оставалась неизменной после добавления иммуномодуляторов (рисунок 2Б). Различия между спонтанной и индуцированной экспрессией МСР-1 у данного донора статистически не значимы (р≥0.05). В аналогичной ситуации у донора 72219 наблюдали достоверный ингибирующий эффект иммуномодуляторов (рисунок 2А). Различия со спонтанной секрецией МСР-1 у донора 72219 статистически значимы (р≤0.05).

В плане продукции IL-8/CXCL8 у обоих доноров наблюдали ингибирующий эффект как от использования полиоксидония, так и от применения имунофана. Различия со спонтанной экспрессией в данном эпизоде статистически значимы (р≤0.05). Однако у донора 72219 различия между индуцированной и спонтанной экспрессией IL-8/CXCL8 носили достоверно (р≤0,05) более выраженный характер по сравнению с таковыми у донора 116427 (рисунок 3). По уровню продукции IL-6 также отмечали достоверный ингибирующий эффект у обоих доноров от применения как полиоксидония, так и имунофана. Различия со спонтанным уровнем экспрессии статистически значимы у обоих доноров (р≤0,05). Но в данном эпизоде степень выявленных различий была достоверно (р≤0,05) более значимой у донора 116427 (рисунок 4).

Как видно из рисунка 5, концентрация МСР-1 в питательной среде с РВМС-клетками была достоверно выше при инкубации с иммуномодуляторами в течение 48 часов. Различие аналогичным параметром при 20-часовой инкубации статистически значимо.

ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие биотехнологий в условиях форсирования персонифицированного подхода в медицине подразумевает особое внимание к возможности применения стимулированных клеток крови. В ответ на внешнюю стимуляцию эти клетки вырабатывают цитокины в донор-специфической манере и поэтому являются перспективным материалом для разработки универсальных клеточных тест-систем по диагностике социально значимых заболеваний воспалительного и аутоиммунного характера. В связи с этим мы провели пилотные эксперименты по оценке продукции ряда цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8 и IFN-α) РВМС-клетками, полученными от здоровых доноров и стимулированными иммуномодуляторами имунофан и полиоксидоний.

По итогам первой серии экспериментов наиболее отчетливо было продемонстрировано отсутствие спонтанной или индуцированной иммуномодуляторами продукции IFN-α. Эти данные соответствуют раннее опубликованным в литературе сведениям, в частности, о том, что полиоксидоний-стимулированные клетки крови не способны индуцировать синтез IFN-α, но обладают модулирующей активностью в плане продукции цитокинов: IL-1β, IL-6, TNFα [7]. Нами было показано, что имунофан также не стимулирует выработку IFN-α РВМС-клетками от здоровых доноров. В случае МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8 оценка их продукции РВМС-клетками от 5 здоровых доноров продемонстрировала количественно определяемую (достоверно выше барьера чувствительности ИФА) секрецию данных цитокинов в питательную среду.

В экспериментах с клетками индивидуальных доноров в большинстве случаев наблюдали четко выраженный ингибирующий эффект обоих иммуномодуляторов на продукцию цитокинов МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8. Данные цитокины принимают участие в патогенезе различных заболеваний: IL-6 – это многофункциональный цитокин, содержание которого в крови повышено на фоне острых и хронических форм воспаления и аутоиммунных процессов. Последние имеют место при таких социально значимых патологиях, как ревматоидный артрит, псориаз, болезнь Кастлемана и др. [22–24]. МСР-1/CCL2 и IL-8/CXCL8 являются мощными медиаторами воспаления, относящимися к группе хемокинов, основная функция которых состоит в стимуляции передвижения иммунных клеток к очагу воспаления [25–27]. Представленные в данном исследовании цитокины МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8 уже служат диагностическими маркерами некоторых нозологий, и их применение в диагностике вышеперечисленных социально значимых заболеваний несомненно растет с каждым годом [28–29]. Обнаружение индивидуальной вариабельности продукции цитокинов МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8 РВМС-клетками крови от разных доноров в ответ на стимуляцию иммуномодуляторами является важной предпосылкой для развития персонифицированных диагностических тестов с использованием клеток крови пациентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Первая серия экспериментов позволила оценить, какие из анализируемых цитокинов (МСР-1/CCL2, IL-6, IL-8/CXCL8, IFN-α) продуцируются РВМС-клетками в питательную среду в условиях in vitro. Результаты этой серии указывают на отсутствие продукции IFN-α РВМС-клетками крови и на их способность продуцировать IL-6, IL-8/CXCL8, МСР-1/CCL2 при данных экспериментальных условиях. Существенный разброс в стандартных отклонениях значений в первой серии экспериментов, когда клетки от 5 доноров были объединены в один лот, вероятно, связан с донор-специфичной вариабельностью продукции отдельных цитокинов. Для подтверждения данной гипотезы мы провели вторую серию экспериментов.

Вторая серия экспериментов была проведена с РВМС-клетками, выделенными от индивидуальных доноров. Следует отметить, что в данной серии экспериментов РВМС были предварительно проинкубированы в бессывороточной среде в течение ночи и на следующий день, перед добавлением иммуномодуляторов, были отмыты от питательной среды. Таким образом, накопленные за ночь цитокины были удалены, что давало возможность после инкубации в течение 20 часов более точно оценить влияние иммуномодуляторов на синтез цитокинов. Данная серия экспериментов достоверно продемонстрировала индивидуальную вариабельность в продукции отдельных цитокинов и подтвердила нашу гипотезу.

Чтобы убедиться, что существует накопительный эффект продукции цитокинов во времени, была проведена третья серия экспериментов: к предварительно проинкубированным РВМС-клеткам донора 116427 были добавлены иммуномодуляторы без смены питательной среды с последующей инкубаций в течение 48 часов. Содержание цитокина МСР-1/CCL2 в данной серии экспериментов было достоверно (на порядок) выше, чем во второй серии, подтвердив наличие накопительного эффекта.

В целом проведенный in vitro скрининг продукции цитокинов в питательную среду РВМС-клетками в присутствии иммуномодуляторов имунофан и полиоксидоний продемонстрировал отсутствие продукции IFN-α наряду с индивидуальной вариабельностью продукции IL-6, IL-8/CXCL8, МСР-1/CCL2, что может быть использовано при создании универсальных клеточных тест-систем in vitro для персонифицированной диагностики ряда социально значимых заболеваний воспалительного и аутоиммунного характера.

Конфликт интересов: все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

×

About the authors

Larisa T. Volova

Samara State Medical University

Email: l.t.volova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-8510-3118

PhD, Professor, Director of the RDC “BioTech”

Russian Federation, Samara

Natalya K. Osina

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: n.k.osina@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-0444-8174
SPIN-code: 6054-3300
Scopus Author ID: 6508362133

PhD, Leading researcher at the RDC “BioTech”

Russian Federation, Samara

Sergei I. Kuznetsov

Samara State Medical University

Email: s.i.kuznecov@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4302-8946
SPIN-code: 7028-9499

PhD, Leading researcher at the RDC “BioTech”

Russian Federation, Samara

Oksana A. Gusyakova

Samara State Medical University

Email: o.a.gusyakova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8140-4135

PhD, Head of the Department of Fundamental and Clinical Biochemistry with Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Samara

Denis G. Alekseev

Samara State Medical University

Email: d.g.alekseev@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4185-0709
SPIN-code: 4983-9830
Scopus Author ID: 57219450524
ResearcherId: AAX-8047-2020

PhD, Leading researcher at the RDC “BioTech”, Associate professor, Department of General Surgery

Russian Federation, Samara

Evgenii I. Pugachev

Samara State Medical University

Email: evgenesius@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3594-0874
SPIN-code: 6700-2103

researcher at the RDC “BioTech”

Russian Federation, Samara

Sergei A. Goncharenko

Samara State Technical University

Email: S.A.Goncharenko@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-8460-9053

student

Russian Federation, Samara

References

  1. Ter Horst R, Jaeger M, Smeekens SP, et al. Host and Environmental Factors Influencing Individual Human Cytokine Responses. Cell. 2016;167(4):1111-1124.e13. doi: 10.1016/j.cell.2016.10.018
  2. Gonçalves TO, Costa D, Brodskyn CI, et al. Release of cytokines by stimulated peripheral blood mononuclear cells in chronic periodontitis. Arch Oral Biol. 2010;55(12):975-980. doi: 10.1016/J.ARCHORALBIO.2010.08.002
  3. Antonakos N, Tsaganos T, Oberle V, et al. Decreased cytokine production by mononuclear cells after severe gram-negative infections: Early clinical signs and association with final outcome. Critical Care. 2017;1(21):1-10. doi: 10.1186/s13054-017-1625-1
  4. Schirmer M, Smeekens SP, Vlamakis H, et al. Linking the Human Gut Microbiome to Inflammatory Cytokine Production Capacity. Cell. 2016;167(7):1897. doi: 10.1016/j.cell.2016.11.04
  5. Li Y, Oosting M, Smeekens SP, et al. A Functional Genomics Approach to Understand Variation in Cytokine Production in Humans. Cell. 2016;167(4):1099-1110.e14. doi: 10.1016/j.cell.2016.10.017
  6. De Werra I, Zanetti G, Faccard C, et al. CD14 expression on monocytes and TNFα production in patients with septic shock, cardiogenic shock or bacterial pneumonia. Swiss Med Wkly. 2001;131(3-4):35-40. doi: 2001/03/smw-05883
  7. Pinegin BV, Nekrasov AV, Haitov RM, et al. Immunomodulator polyoxidonium: mechanisms of action and aspects of clinical application. Cytokines and inflammation. 2004;3:41-47. (In Russ.). [Пинегин Б.В., Некрасов А.В., Хаитов Р.М., и др. Иммуномодулятор полиоксидоний: механизмы действия и аспекты клинического применения. Цитокины и воспаление. 2004;3:41-47].
  8. Kostinov MP, Akhmatova NK, Khromova EA, Kostinova AM. Cytokine Profile in Human Peripheral Blood Mononuclear Leukocytes Exposed to Immunoadjuvant and Adjuvant-Free Vaccines Against Influenza. Front Immunol. 2020;11:1-10. doi: 10.3389/fimmu.2020.01351
  9. Alexia C, Cren M, Louis-Plence P, et al. Polyoxidonium® Activates Cytotoxic Lymphocyte Responses Through Dendritic Cell Maturation: Clinical Effects in Breast Cancer. Front Immunol. 2019;10:1-15. doi: 10.3389/fimmu.2019.02693
  10. Petrov RV, Haitov RM, Nekrasov AV, et al. Polyoxidonium: Mechanism of Action and Clinical Application. Medical Immunology. 2000;3:271-278. (In Russ.). [Петров Р.В., Хаитов Р.М., Некрасов А.В., и др. Полиоксидоний: механизм действия и клиническое применение. Медицинская иммунология. 2000;3:271-278].
  11. Kolosova NG. Acute respiratory infections in frequently ill children: rational etiotropic therapy. Russian Medical Journal. 2014;3:204-207. (In Russ.). [Колосова Н.Г. Острые респираторные инфекции у часто болеющих детей: рациональная этиотропная терапия. Русский медицинский журнал. 2014;3:204-207].
  12. Kharlamova FS, Uchaikin VF, Kuz'menko LV, et al. Experience of using the Polyoxidonium immunomodulator for the treatment of acute respiratory infections in children. Effective Pharmacotherapy. 2013;11:12-20. (In Russ.). [Харламова Ф.С., Учайкин В.Ф., Кузьменко Л.В., и др. Опыт применения иммуномодулятора Полиоксидоний для лечения ОРИ у детей. Эффективная фармакотерапия. 2013;11:12-20].
  13. Varfolomeeva MI, Setdikova NKh. Modern possibilities of immunomodulatory therapies in the preventionand treatment of ARI. Consilium Medicum. 2015;17(3):63-69. (In Russ.). [Варфоломеева М.И., Сетдикова Н.Х. Современные возможности иммуномодулирующей терапии в профилактике и лечении острых респираторных инфекций. Consilium Medicum. 2015;7(3):63-69].
  14. Ivardava MI. Use of immunomodulators in acute respiratory infection treatment in frequently ill children. Current Pediatrics. 2011;10(3):103-107. (In Russ.). [Ивардава М.И. Место иммуномодуляторов в лечении острой респираторной инфекции у часто болеющих детей. Вопросы современной педиатрии. 2011;10(3):103-107].
  15. Vavilova VP, Perevoshchikova NK, Rizo AA, et al. The use of the domestic immunomodulator Polyoxidonium in the practice of treating children with pathology of the lymphopharyngeal ring. Allergology and Immunology in Paediatrics. 2005;1(4):47-53. (In Russ.). [Вавилова В.П., Перевощикова Н.К., Ризо А.А., и др. Применение отечественного иммуномодулятора Полиоксидония в практике лечения детей с патологией лимфоглоточного кольца. Аллергология и иммунология в педиатрии. 2005;1(4):47-53].
  16. Lebedev VV, Pokrovskij VI. Imunofan: new generation synthetic peptide agent. Vestnik Rossijskoj akademii nauk. 1999;4:56-61. (In Russ.). [Лебедев В.В., Покровский В.И. Имунофан: синтетический пептидный агент нового поколения. Вестник Российской академии наук. 1999;4:56-61].
  17. Markova TP, Chuvirov DG. Immunotherapy with Imunofan to the treatment of children with recurrent respiratory deseasis and mycoplasma pneumoniae infection. Effective Pharmacotherapy. 2022;18(12):12-18. (In Russ.). [Маркова Т.П., Чувиров Д.Г. Имунофан в комплексном лечении детей с повторными респираторными заболеваниямии микоплазменной инфекцией. Эффективная фармакотерапия. 2022;18(12):12-18.
  18. Butorov IV, Osojanu JuP, Butorov SI, Maksimov VV. Immunological and pathogenetic aspects of imunofan administration in aged patients with duodenal ulcer. Vestnik Rossijskoj akademii nauk. 2007;79(2):18-22. (In Russ.). [Бутуров И.В., Осояну Ю.П., Бутуров С.И., Максимов В.В. Иммунологические и патогенетические аспекты введения имунофана у пациентов пожилого возраста с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки. Вестник Российской академии наук. 2007;79(2):18-22]. PMID: 17460962
  19. Venediktova MA Use of tactivin and imunofan for the treatment of patients with endometrial carcinoma. Experimental and Clinical Pharmacology. 2001;64(5):46-9. (In Russ.). [Венедиктова М.А. Применение активина и имунофана для лечения пациенток с карциномой эндометрия. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2001;64(5):46-9. PMID: 11764501
  20. Zabrodskij PF, Lim VG, Strel’tsova EV Disturbances of immune status and cytokine profile caused by chronic intoxication with organophosphorus compounds and their correction by administration of imunofan. Experimental and Clinical Pharmacology. 2012;75(2):35-37. (In Russ.). [Забродский П.Ф., Лим В.Г., Стрельцова Е.В. Нарушения иммунного статуса и цитокинового профиля, вызванные хронической интоксикацией фосфорорганическими соединениями и их коррекция введением имунофана. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2012;75(2):35-37]. doi: 10.30906/0869-2092-2012-75-2-35-37
  21. Bøyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand J Clin Lab Invest. 1968;21:77-89.
  22. Tanaka T, Narazaki M, Kishimoto T. Interleukin (IL-6) Immunotherapy. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018;10(8):1-15. doi: 10.1101/cshperspect. a028456
  23. Dispenzieri A, Fajgenbaum DC. Overview of castleman disease. Blood. 2020;135(16):1353-1364. doi: 10.1182/BLOOD.2019000931
  24. Osina NK, Pugachev EI, Kolyadenko IA, et al. Test-system in vitro for screening of therapeutic drugs with IL-17A inhibitory activity. Genes and Cells. 2021;16(1):43-48. (In Russ.). [Осина Н.К., Пугачев Е.И., Коляденко И.А., и др. Тест-система in vitro для скрининга лекарственных препаратов с IL-17а ингибирующей активностью. Гены & Клетки. 2021;16(1):43-48]. doi: 10.23868/202104006
  25. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1): An overview. J Interf Cytokine Res. 2009;29(6):313-325. doi: 10.1089/jir.2008.0027
  26. Moore BB, Kunkel SL. Attracting Attention: Discovery of IL-8/CXCL8 and the Birth of the Chemokine Field. J Immunol. 2019; 202(1):3-4. doi: 10.4049/jimmunol.1801485
  27. Singh S, Anshita D, Ravichandiran V. MCP-1: Function, regulation, and involvement in disease. Int Immunopharmacol. 2021;101(Pt B):107598. doi: 10.1016/j.intimp.2021.107598
  28. Lee YH, Song GG. Urinary MCP-1 as a biomarker for lupus nephritis: a meta-analysis. Z Rheumatol. 2017;76(4):357-363. doi: 10.1007/s00393-016-0109-z
  29. Chase KA, Cone JJ, Rosen C, Sharma RP. The value of interleukin 6 as a peripheral diagnostic marker in schizophrenia. BMC Psychiatry. 2016;16(1):1-7. doi: 10.1186/s12888-016-0866-x

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. Figure 1. In vitro screening of cytokines MCP-1/CCL2 (A), IL-6 (B), IL-8/CXCL8 (C) production by PBMCs obtained from 5 healthy donors (joined lot).

Download (237KB)
2. Figure 2. Comparison of MCP-1 production by PBMCs from individual donors No. 72219 (A) and No. 116427 (В) in response to stimulation with immunomodulators.

Download (145KB)
3. Figure 3. Comparison of IL-8 production by PBMCs from individual donors No. 72219 (A) and No. 116427 (В) in response to stimulation with immunomodulators.

Download (149KB)
4. Figure 4. Comparison of the IL-6 production by PBMCs from individual donors No. 72219 (A) and No. 116427 (В) in response to stimulation with immunomodulators.

Download (130KB)
5. Figure 5. Comparison of MCP-1 production into the breeding ground by PBMCs obtained from donor No. 116427 after incubation with immunomodulators during 20 and 48 hours.

Download (86KB)

Copyright (c) 2022 Volova L.T., Osina N.K., Kuznetsov S.I., Gusyakova O.A., Alekseev D.G., Pugachev E.I., Goncharenko S.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-65957 от 06 июня 2016 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies