Ультраструктура тироцитов и оценка их функционального состояния после длительного воздействия бензоата натрия и моделирования перелома костей, и обоснование эффективности мексидола и селеназы

Полный текст

Введение. Щитовидная железа является одной из периферических желез внутренней секреции, которая регулирует метаболизм белков, жиров и углеводов, а также кальциево-фосфорный гомеостаз. Ее фолликулярные клетки отличаются высокой чувствительностью к различным экзогенным и эндогенным воздействиям [1]. В частности, при тяжелой травме имеет место уменьшение уровня гормонов - тироксина и трийодтиронина, что носит адаптационно-компенсаторный характер и направлено на сохранение оптимального уровня анаболизма и сокращения энергозатрат организма [2].

В более ранней работе было установлено, что фолликулярные клетки щитовидной железы являются чувствительными к длительному воздействию бензоата натрия [3], что, основываясь на выявленных электронно-микроскопических изменениях указывало на их гипофункцию. Бензоат натрия является широко распространенной и применяемой пищевой добавкой из группы консервантов, которая уменьшает активность бактерий и грибков и способствует повышению сроков хранения продуктов питания, средств личной гигиены и лекарств [4]. Если данные об изолированном влиянии бензоата натрия на строение, секреторный потенциал щитовидной железы имеются в литературе, то ее морфологические особенности в период после его длительного введения и смоделированного травматического воздействия кости отсутствуют. Соответственно не освещены способы коррекции данных воздействий, в том числе и фармакологические.

Учитывая, что одним из механизмов неблагоприятного действия бензоата натрия и травмы как внешнего фактора является инициирование оксидативного стресса, прооксидантное действие, активация свободнорадикального окисления перспективным представляется использование препаратов с антиоксидантными, мембранопротекторными и антигипоксантными свойствами – мексидола и селеназы [5, 6].

Цель. При помощи электронной микроскопии изучить влияние 60-ти дневного воздействия бензоата натрия в различных дозах и последующего нанесения травмы в большеберцовых костях на фолликулярные клетки щитовидной железы крыс и обосновать эффективность мексидола и селеназы в качестве корректоров.

Материал и методы. Общее количество лабораторных животных, вовлеченных в эксперимент, составило 84 особи. В качестве материала исследования выбор остановился на белых лабораторных крысах. Для устранения фактора влияния циклических гормональных изменений на результаты использовали крыс-самцов. В момент введения в исследование крысы имели массу 200-210 г. и находились в половозрелом возрасте репродуктивного периода онтогенеза. Животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде в чистых, хорошо проветриваемых пластиковых клетках по 6 особей в каждой. Моделирование длительного воздействия бензоата натрия осуществлялось путем 60-ти суточного внутрижелудочного введения раствора данной пищевой добавки в дозах 500 и 1000 мг/кг/массы тела, а травматического воздействия (перелома) – оперативным вмешательством, заключающемся в перфорировании проксимальной трети тела большеберцовых костей стоматологическим бором диаметром 2,2 мм (группы 1БНД и 2БНД) [7]. Контрольной группой к вышеуказанным явилась группа КД, в которой крысы получили 0,9% изотонический раствор хлорида натрия в аналогичные сроки и объеме с последующим нанесением травматического воздействия. После оперативного вмешательства животное сохраняло опору на оперированные задние конечности, поскольку нарушение непрерывности строения большеберцовых костей не наступало. Для установления фармакологической эффективности мексидола (международное непатентованное название – этилметилгидроксипиридина сукцинат) и селеназы (натрия селенит) дополнительно вводились 4 экспериментальные группы (группы 1БНД+М, 2БНД+М, 1БНД+С, 2БНД+С). Мексидол использовался от производителя ООО Медицинский центр «Эллара», РФ), вводился внутримышечно из расчета 50 мг/кг, а селеназа - Биосин Арцнаймиттель ГмбГ, Германия в дозе 40 мкг/кг/сутки. При расчетах вводимых доз пищевых добавок и лекарственных препаратов использовали формулу Рыболовлевых с учетом видовой выносливости для крыс [8]. Забор щитовидных желез осуществляли на 3 и 24 сутки после нанесения дефекта в большеберцовых костях, крыс умерщвляли методом декапитации. Доли щитовидной железы сепарировали на мелкие кусочки, помещали в микропробирки с 2,5% раствором глютарового альдегида, с последующим их переносом в 1% раствор тетроксида осмия на фосфатном буфере для фиксации. Следующий этап обработки заключался в дегидратации кусочков сначала в этаноле постепенно увеличивающейся концентрации, а затем в абсолютном ацетоне. Далее образцы заливали в смесь эпона и аралдита, и полимеризировали в термостате 36 часов при 60⁰С. Полутонкие срезы с блоков получали с использованием ультрамикротома УМТП-4 Сумского ПО «Электрон». По методу E. Reynolds срезы контрастировались в растворах уранилацетата и цитрата свинца, а далее анализировались и фотографировались с помощью электронного микроскопа ЕМ-125. На электронограммах оценивали форму клеток, ядра, распределение хроматина в нем, форму, степень развития цистерн гранулярной эндоплазматической сети, их содержимое, форму и электронную плотность содержимого митохондрий и лизосом, а также развитие микроворсинок на апикальной поверхности клеток. Для количественной оценки изменений структурных компонентов тироцитов и определения их функционального состояния использовали способ, разработанный и запатентованный автором работы [9], а технические расчеты производили в созданной для этих целей программе для ЭВМ [10]. Структурным компонентам тироцитов – ядру, кариолемме, перинуклеарному пространству, ядрышку, хроматину, гранулярной эндоплазматической сети, митохондриям и плазмолемме присваивались числовые значения, сумма которых определяла их функциональное состояние на электронограммах (норму (30-37 баллов), гипофункцию (9-20), гиперфункцию (21-31), митоз (7-8)).

Результаты. Фолликулярные клетки щитовидной железы в группе 1БНД на третьи сутки исследования были, в основном, кубической формы. В фолликуле могли также определяться клетки как призматической, так и плоской формы. Ядро тироцитов, учитывая полиморфность клеточного состава, было круглым или овальным. Неактивный хроматин располагался не только на периферии ядра, но и в его центральных участках. Цистерны гранулярной эндоплазматической сети были расширены. Часть из них содержала фибриллярные структуры, расположенные рыхло. Митохондрии были разной электронной плотности, а некоторые из них содержали участки разрушенного матрикса. Лизосомы средних размеров, располагались одиночно или группами с электронно-плотным гетерогенным содержимым, единичные секреторные гранулы определялись редко. Участок клетки, обращенный в сторону коллоида, содержал короткие микроворсинки. Во второй половине эксперимента в поле зрения фолликулов с тироцитами разной формы встречалось меньше. Гетерохроматин располагался в виде тонкого ободка на периферии ядра, с единичными глыбками в кариоплазме. Лизосомы разного размера имели относительно гомогенное содержимое. При определении функционального состояния данных клеток на электронограммах установлено, что на 3 сутки наблюдения оно соответствовало гипофункции (15,80±0,20 баллов), однако к 24 суткам сменялось на нормофункцию (30,00±0,21 баллов).

У крыс в группе 2БНД в начале исследования определялась динамика изменений сходная с вышеописанной, но при этом выявлялись некоторые особенности. В цитоплазме визуализировались растянутые канальцы гранулярной эндоплазматической сети. Некоторых из них имели форму «озера». В клетках встречались сферической формы митохондрии с полностью разрушенным содержимым. В поле зрения определялись клетки с признаками апоптоза. На 24 сутки выявленные изменения были в основном сходными с ранними сроками наблюдения. В одной клетке могли встречаться митохондрии с типичным строением, с электронно-плотным содержимым, а также со светлыми участками матрикса. Выявлялись одиночные лизосомы средних и крупных размеров. При определении функционального состояния тироцитов выявлено, что оно остается сниженным как на 3, так и на 24 сутки наблюдения составляя 13,80±0,20 и 15,00±0,21 баллов соответственно.

В группе 1БНД+М на третьи сутки тироциты также, как и в группе 1БНД были, в основном, кубической формы. Ядро имело слегка волнообразные контуры. Часть кариолеммы местами имела пальцеобразные впячивания. Эухроматин располагался в центральных участках ядра. Цистерны гранулярной эндоплазматической сети имели неравномерные умеренно расширенные пространства, которые участками приобретали сферическую форму. В клетке визуализировались секреторные гранулы и немногочисленные митохондрии. Апикальный конец фолликулярных клеток содержал неизмененные низкие микроворсинки. Среди типичных митохондрий встречались крупных размеров с размытым содержимым. Лизосомы располагались поодиночке, реже группами. На 24 сутки наблюдения клетки имели как кубическую, так и призматическую форму, а в единичных случаях плоскую. Неактивный хроматин тонким ободком локализовался под извилистой кариолеммой. Просветы цистерн гранулярной эндоплазматической сети были неравномерно расширены. Микроворсинки имели средние размеры. Лизосомы разной величины поодиночке или группами располагались в цитоплазме. Как и в группе 1БНД на 3 сутки наблюдения функциональное состояние тироцитов соответствовало гипофункции (17,50±0,22 баллов) и на 24 сутки восстанавливалось до нормофункции (33,80±0,20 баллов).

В группе 2БНД+М прослеживались однонаправленные изменения с аналогичными в группе 1БНД+М. Из особенностей стоит отметить, что активный хроматин занимал, преимущественно, центральные отделы кариоплазмы, была выявлена клетка с расположением неактивного хроматина в виде «дорожки», встречались лизосомы разного размера с электронно-плотным гетерогенным содержимым, короткие микроворсинки. В поздние сроки эухроматин преобладал в центре ядра с неровными контурами. Определялись круглые, реже овальные, мелкие митохондрии. Оценка функционального состояния тироцитов на электронограммах щитовидной железы крыс группы 2БНД+М показала, что на 3 сутки оно было пониженным, как и в группе 2БНД (15,00±0,15 баллов), однако на 24 сутки восстанавливалось до нормальной функции, в отличие от группы 2БНД (31,10±0,28 баллов).

Анализ структурных особенностей тироцитов на электроннограммах в группе 1БНД+С выявил положительную динамику, как и в группе 1БНД+М. С учетом общего характера изменений, необходимо также отметить выявленные особенности: контуры ядра были волнистые, определялось ядрышко, лизосомы имели разный размер, встречались единичные секреторные гранулы, аутофагосомы и митохондрии с нарушением целостности мембраны (в ранние сроки наблюдения), а также преимущественно овальной формы типичные митохондрии (в поздние сроки наблюдения) (Рис. 1). Гипофункция тироцитов была установлена при оценке их функционального состояния на 3 сутки наблюдения (16,90±0,18 баллов) и нормофункция – на 24 сутки (32,60±0,16 баллов).

Рис. 1. Электронномикроскопические особенности тироцитов щитовидной железы половозрелых крыс на 3 сутки эксперимента (а – группа 1БНД, б – группа 2БНД, в – группа 1БНД+М, г – группа 2БНД+М, д – группа 1БНД+С, е – группа 2БНД+С): тц – тироцит, я – ядро, гх – гетерохроматин, д – гетерохроматин в виде дорожки, яд – ядрышко, э – гранулярная эндоплазматическая сеть, м – митохондрии, мр – митохондрии с разрушенным участком, л – лизосомы, ау – аутофагосома, сг – секреторные гранулы, мв – микроворсинка, к – капилляр, рфс – рыхло расположенные фибриллярные структуры в полости цистерны гранулярной эндоплазматической сети, фс – концентрически скрученные фибриллярные структуры в полости цистерны гранулярной эндоплазматической сети, а – клетка с признаками апоптоза. Ув.×8000.

Fig. 1. Electron microscopic features of mature rat’s thyroid gland thyrocytes on the day 3 of the experiment (a – group 1SBD, b – group 2SBD, c – group 1SBD+M, d – group 2SBD+M, e – group 1SBD+S, f – group 2SBD+S): тц – thyrocyte, я – nucleus, гx – heterochromatin, д – heterochromatin in the form of a lane, яд – nucleolus, э – rough endoplasmic reticulum, м – mitochondria, мр – mitochondria with a destroyed area, л – lysosomes, ay – autophagosome, сг – secretory granules, мв – microvilli, к – capillary, рфс – loosely located fibrillar structures in the cavity of the cistern of the rough endoplasmic reticulum, фс – concentrically twisted fibrillar structures in the cavity of the cistern of the rough endoplasmic reticulum, a – cell with signs of apoptosis. Magnification×8000.

Ультраструктурные изменения в группе 2БНД+С сопоставимы с группой 1БНД+С, но имелись некоторые отличия. Так, в начале наблюдения эухроматин располагался в центральных участках ядра между гетерохроматином. Встречались лизосомы крупных размеров с электронно-плотным гетерогенным содержимым. В полости цистерн гранулярной эндоплазматической сети выявлялись концентрически скрученные фибриллярные структуры. Встречались митохондрии типичного строения, овальные или круглые в сечении, с плотным или частично разрушенным содержимым. К 24 суткам часть контуров ядра имела вид ямкообразных углублений. Лизосомы на периферии цитоплазмы могли располагаться группами, а в ее центре – поодиночке (Рис. 2). Оценка функционального состояния тироцитов на электронограммах показала, что на 3 и 24 сутки оно соответствовало гипофункции (13,60±0,16 и 19,30±0,21 баллов).

Рис. 2. Электронномикроскопические особенности тироцитов щитовидной железы половозрелых крыс на 24 сутки эксперимента (а – группа 1БНД, б – группа 2БНД, в – группа 1БНД+М, г – группа 2БНД+М, д – группа 1БНД+С, е – группа 2БНД+С): тц – тироцит, я – ядро, гх – гетерохроматин, яд – ядрышко, э – гранулярная эндоплазматическая сеть, м – митохондрии, мр – митохондрии с разрушенным участком, л – лизосомы, сг – секреторные гранулы, к – капилляр, рфс – рыхло расположенные фибриллярные структуры в полости цистерны гранулярной эндоплазматической сети. Ув.×8000.

Fig. 2. Electron microscopic features of mature rat’s thyroid gland thyrocytes on the day 24 of the experiment (a – group 1SBD, b – group 2SBD, c – group 1SBD+M, d – group 2SBD+M, e – group 1SBD+S, f – group 2SBD+S): тц – thyrocyte, я – nucleus, x – heterochromatin, яд – nucleolus, э – rough endoplasmic reticulum, м – mitochondria, мр – mitochondria with a destroyed area, л – lysosomes, сг – secretory granules, к – capillary , рфс – loosely located fibrillar structures in the cavity of the cistern of the rough endoplasmic reticulum. Magnification×8000.

 Обсуждение. Согласно работам исследователей бензоат натрия вызывает дисбаланс оксидантно-антиоксидантной системы, через активацию перекисного окисления липидов, увеличение свободных форм кислорода и ингибирование антиоксидантных ферментов. При этом он способен активизировать процессы апоптоза и увеличивать уровень воспалительных цитокинов – TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6 (последнее по принципу «замкнутого круга» усиливают оксидативный стресс) [11]. Также, консервант способен повреждать ДНК [12], цитолемму и внутреннюю мембрану митохондрий, снижать уровень гемоглобина и значение индекса митотического деления [13]. Имеются данные о том, что бензоат натрия снижает уровень Т₃, Т₄ и тиреотропного гормона [14], а также повышает уровень Na⁺ [12]. Длительное употребление бензоата натрия согласно уже опубликованным данным автора статьи на ультраструктурном уровне подтверждает зависимое от дозы снижение функции фолликулярных клеток [3]. Далее в ходе эксперимента, после двухмесячного использования консерванта наносился дефект в большеберцовых костях. По данным литературы, такое воздействие практически не оказывает влияния на уровень тиреотропного гормона, при этом также уменьшается уровень Т₃ и Т₄ [15]. На фоне гипофункции тироцитов, вызванной бензоатом натрия и травмой, включается механизм «обратной петли» (так как бензоат натрия уже не поступает в организм) и уровень тиреотропного гормона может восстанавливаться или возрастать [16], вызывая гипертрофию тироцитов [17]. В литературе данный факт объясняется несколькими механизмами. Во-первых, считается, что при повреждении плазмолеммы и митохондрий может нарушаться работа Na⁺/K⁺ насоса [18, 19]. Во-вторых, изменения в генетическом материале способствуют синтезу нетипичных тиреоглобулинов, упаковка которых происходит неправильно с последующим их захватом и накоплением в эндоплазматической сети, что приводит к развитию ее стресса и гипофункции фолликулярных клеток. Этот процесс является обратимым и зависит от природы патологического фактора, его дозы и длительности влияния [16]. Вышеперечисленное позволяет объяснить, что кубическая, реже призматическая форма клеток, обусловлена наличием растянутых канальцев гранулярной эндоплазматической сети в тироцитах (в ее полостях в единичных случаях определяются концентрически скрученные фибриллярные структуры), то есть так называемым ее стрессом, что вместе с низкими микроворсинками, частью митохондрий с разрушенным матриксом, единичными секреторными гранулами и обилием гетерохроматина в ядре морфологически подтверждают гипофункцию клеток в ранние сроки наблюдения. Учитывая, динамику положительных изменений, проявляющуюся в большей или меньшей степени на 24 сутки, по сравнению с контролем (группа КД), можно утверждать, что изменения вызванные бензоатом натрия являются обратимыми. Также следует отметить, что ультраструктурные изменения не достигают данных группы сравнения даже в группе 1БНД.

Учитывая механизм действия и нарушения, индуцированные бензоатом натрия, для их сглаживания, перед нанесением травмы кости, было использовано два корректора - мексидол и селеназа.

При отщеплении протона от 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (первый компонент препарата мексидола) он связывается с перокси- и алкокси- радикалами, нейтрализуя их (антиоксидантная активность). Остаток янтарной кислоты (второй компонент препарата мексидола) способен поддерживать работу сукцинатоксидазного звена цикла Кребса в условиях дефицита кислорода. Препарат также способен повышать активность селен-зависимой-глутатионпероксидазы [20].

Селен входит в состав глутатионпероксидазы, йодтиронин-дейодиназы 1-го, 2-го и 3-го типов, а также тиоредоксинредуктазы. Глутатионпероксидаза препятствует накоплению свободных радикалов (фермент антиоксидантной защиты); йодтиронин-дейодиназы 1-го типа и 2-го типа - могут синтезироваться в щитовидной железе и инициируют превращение тироксина в трийодтиронин; йодтиронин-дейодиназы 3-го типа - синтезируется только глиальными клетками, кожей и плацентой, и инактивирует Т₃ и Т₄; тиоредоксинредуктаза - восстанавливает тиоредоксин с участием НАДФ+Н⁺, который  является донором атомов водорода для восстановительных процессов (в частности для стабилизации внеклеточных белков, содержащих дисульфидные связи, а также восстанавливает ряд биологически активных соединений, в том числе и  глутатионпероксидазу) [21, 22]. Данный химический элемент способен контролировать работу генов (CASP-3 и CASP-9), отвечающих за митохондриальный путь самозапрограмированной клеточной гибели [23].

Вышеуказанные механизмы дают возможность объяснить зависимые от дозы менее выраженные изменения в группах с использованием мексидола и селеназы, обусловленные приемом консерванта и сквозным дефектом кости (причем на 3 и 24 сутки только в группах 1БНД+М и 1БНД+С ультраструктурные признаки приближаются к аналогичным в группе контроля). Оба препарата вызывают однонаправленные электронномикроскопические изменения, позволяющие в разной мере снижать выраженность морфологических проявлений гипофункции тироцитов на протяжении репаративного остеогенеза.

Выводы.

1. Шестидесятисуточное введение бензоата натрия и нанесение дефекта в большеберцовых костях ультрамикроскопически проявляется в виде гипофункции тироцитов щитовидной железы крыс на 3 сутки эксперимента. В группе, в которой крысы получали бензоат натрия в дозе 500 мг/кг массы тела до момента моделирования перелома кости гипофункция тироцитов сменялась нормофункцией на 24 сутки, в то время как при введении данного консерванта в дозе 1000 мг/кг восстановление функционального состояния не наступало.
2. Использование корректоров – мексидола и селеназы электронно-микроскопически проявляется снижением функции тироцитов на 3 сутки наблюдения, однако к 24 суткам функциональное состояние восстанавливается до нормофункции, особенно в группах, в которых бензоат натрия вводили в дозе 500 мг/кг, что связано со способностью препаратов воздействовать на звенья механизмов действия, как бензоата натрия, так и травмы.

 

Соответствие принципам этики. Протокол исследования утвержден на заседании комиссии по биоэтике ГУ «Луганский государственный медицинский университет им. Святителя Луки», протокол №2 от 25.03.2022 г.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Об авторах

Виталий Николаевич Морозов

ФГАОУ ВО "Белгородский государственный национальный исследовательский университет"

Автор, ответственный за переписку.
Email: morozov_v@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0002-1169-4285

доцент кафедры анатомии и гистологии человека

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы