Ultrastructure of thyrocytes, assessment of their functional state after prolonged exposure to sodium benzoate and simulation of bone fractures and justification for the effectiveness of mexidol and selenase

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Щитовидная железа является одной из периферических желез внутренней секреции, которая регулирует метаболизм белков, жиров и углеводов, а также кальциево-фосфорный гомеостаз. Ее фолликулярные клетки отличаются высокой чувствительностью к различным экзогенным и эндогенным воздействиям [1]. В частности, при тяжелой травме имеет место уменьшение уровня гормонов – тироксина и трийодтиронина, что носит адаптационно-компенсаторный характер и направлено на сохранение оптимального уровня анаболизма и сокращения энергозатрат организма [2].

В более ранней работе было установлено, что фолликулярные клетки щитовидной железы являются чувствительными к длительному воздействию бензоата натрия [3], что на основании выявленных электронно-микроскопических изменений указывало на их гипофункцию. Бензоат натрия является широко распространенной и применяемой пищевой добавкой из группы консервантов, которая уменьшает активность бактерий и грибков и способствует повышению сроков хранения продуктов питания, средств личной гигиены и лекарств [4]. Если данные об изолированном влиянии бензоата натрия на строение, секреторный потенциал щитовидной железы в литературе имеются, то ее морфологические особенности в период после длительного введения бензоата натрия и смоделированного травматического воздействия на кости отсутствуют. Соответственно не освещены способы коррекции данных воздействий, в том числе и фармакологические.

Учитывая, что одним из механизмов неблагоприятного действия бензоата натрия и травмы как внешнего фактора являются инициирование оксидативного стресса, прооксидантное действие, активация свободнорадикального окисления, перспективным представляется использование препаратов с антиоксидантными, мембранопротекторными и антигипоксантными свойствами – мексидола и селеназы [5, 6].

ЦЕЛЬ

При помощи электронной микроскопии изучить влияние 60-дневного воздействия бензоата натрия в различных дозах и последующего нанесения травмы в большеберцовых костях на фолликулярные клетки щитовидной железы крыс и обосновать эффективность мексидола и селеназы в качестве корректоров.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Общее количество лабораторных животных, вовлеченных в эксперимент, составило 84 особи белых лабораторных крыс. Для устранения фактора влияния циклических гормональных изменений на результаты использовали крыс-самцов. В момент введения в исследование крысы имели массу 200–210 г и находились в половозрелом возрасте репродуктивного периода онтогенеза. Животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде в чистых, хорошо проветриваемых пластиковых клетках по 6 особей в каждой. Моделирование длительного воздействия бензоата натрия осуществлялось путем 60-суточного внутрижелудочного введения раствора данной пищевой добавки в дозах 500 и 1000 мг/кг массы тела, а травматического воздействия (перелома) – оперативным вмешательством, заключающимся в перфорировании проксимальной трети тела большеберцовых костей стоматологическим бором диаметром 2,2 мм (группы 1БНД и 2БНД) [7]. Контрольной группой к вышеуказанным явилась группа КД, в которой крысы получили 0,9% изотонический раствор хлорида натрия в аналогичные сроки и объеме с последующим нанесением травматического воздействия. После оперативного вмешательства животное сохраняло опору на оперированные задние конечности, поскольку нарушение непрерывности строения большеберцовых костей не наступало. Для установления фармакологической эффективности мексидола (международное непатентованное название – этилметилгидроксипиридина сукцинат) и селеназы (натрия селенит) дополнительно вводились 4 экспериментальные группы (группы 1БНД+М, 2БНД+М, 1БНД+С, 2БНД+С). Мексидол использовался от производителя ООО Медицинский центр «Эллара», РФ), вводился внутримышечно из расчета 50 мг/кг, а селеназа – Биосин Арцнаймиттель ГмбГ, Германия в дозе 40 мкг/кг/сутки. При расчетах вводимых доз пищевых добавок и лекарственных препаратов использовали формулу Рыболовлевых с учетом видовой выносливости для крыс [8]. Забор щитовидных желез осуществляли на 3 и 24 сутки после нанесения дефекта в большеберцовых костях, крыс умерщвляли методом декапитации. Доли щитовидной железы сепарировали на мелкие кусочки, помещали в микропробирки с 2,5% раствором глютарового альдегида, с последующим их переносом в 1% раствор тетроксида осмия на фосфатном буфере для фиксации. Следующий этап обработки заключался в дегидратации кусочков сначала в этаноле постепенно увеличивающейся концентрации, а затем в абсолютном ацетоне. Далее образцы заливали в смесь эпона и аралдита и полимеризировали в термостате 36 часов при 60°С. Полутонкие срезы с блоков получали с использованием ультрамикротома УМТП-4 Сумского ПО «Электрон». По методу E. Reynolds срезы контрастировались в растворах уранилацетата и цитрата свинца, а далее анализировались и фотографировались с помощью электронного микроскопа ЕМ-125. На электронограммах оценивали форму клеток, ядра, распределение хроматина в нем, форму, степень развития цистерн гранулярной эндоплазматической сети, их содержимое, форму и электронную плотность содержимого митохондрий и лизосом, а также развитие микроворсинок на апикальной поверхности клеток. Для количественной оценки изменений структурных компонентов тироцитов и определения их функционального состояния использовали способ, разработанный и запатентованный автором работы¹, а технические расчеты производили в созданной для этих целей программе для ЭВМ². Структурным компонентам тироцитов – ядру, кариолемме, перинуклеарному пространству, ядрышку, хроматину, гранулярной эндоплазматической сети, митохондриям и плазмолемме – присваивались числовые значения, сумма которых определяла их функциональное состояние на электронограммах (норма – 30–37, гипофункция – 9–20, гиперфункция – 21–31, митоз – 7–8 баллов).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Фолликулярные клетки щитовидной железы в группе 1БНД на третьи сутки исследования были в основном кубической формы. В фолликуле могли также определяться клетки как призматической, так и плоской формы. Ядро тироцитов, учитывая полиморфность клеточного состава, было круглым или овальным. Неактивный хроматин располагался не только на периферии ядра, но и в его центральных участках. Цистерны гранулярной эндоплазматической сети были расширены. Часть из них содержала фибриллярные структуры, расположенные рыхло. Митохондрии были разной электронной плотности, а некоторые из них содержали участки разрушенного матрикса. Лизосомы средних размеров, они располагались одиночно или группами с электронно-плотным гетерогенным содержимым, единичные секреторные гранулы определялись редко. Участок клетки, обращенный в сторону коллоида, содержал короткие микроворсинки. Во второй половине эксперимента в поле зрения фолликулов с тироцитами разной формы встречалось меньше. Гетерохроматин располагался в виде тонкого ободка на периферии ядра, с единичными глыбками в кариоплазме. Лизосомы разного размера имели относительно гомогенное содержимое. При определении функционального состояния данных клеток на электронограммах установлено, что на третьи сутки наблюдения оно соответствовало гипофункции (15,80±0,20 балла), однако к 24 суткам сменялось на нормофункцию (30,00±0,21 балла).

У крыс в группе 2БНД в начале исследования определялась динамика изменений, сходная с вышеописанной, но при этом выявлялись некоторые особенности. В цитоплазме визуализировались растянутые канальцы гранулярной эндоплазматической сети. Некоторых из них имели форму «озера». В клетках встречались сферической формы митохондрии с полностью разрушенным содержимым. В поле зрения определялись клетки с признаками апоптоза. На 24-е сутки выявленные изменения были в основном сходными с ранними сроками наблюдения. В одной клетке могли встречаться митохондрии с типичным строением, с электронно-плотным содержимым, а также со светлыми участками матрикса. Выявлялись одиночные лизосомы средних и крупных размеров. При определении функционального состояния тироцитов выявлено, что оно остается сниженным как на третьи, так и на 24-е сутки наблюдения, составляя 13,80±0,20 и 15,00±0,21 балла соответственно.

В группе 1БНД+М на третьи сутки тироциты так же, как и в группе 1БНД, были в основном кубической формы. Ядро имело слегка волнообразные контуры. Часть кариолеммы местами имела пальцеобразные впячивания. Эухроматин располагался в центральных участках ядра. Цистерны гранулярной эндоплазматической сети имели неравномерные умеренно расширенные пространства, которые участками приобретали сферическую форму. В клетке визуализировались секреторные гранулы и немногочисленные митохондрии. Апикальный конец фолликулярных клеток содержал неизмененные низкие микроворсинки. Среди типичных митохондрий встречались крупных размеров с размытым содержимым. Лизосомы располагались поодиночке, реже группами. На 24-е сутки наблюдения клетки имели как кубическую, так и призматическую форму, а в единичных случаях плоскую. Неактивный хроматин тонким ободком локализовался под извилистой кариолеммой. Просветы цистерн гранулярной эндоплазматической сети были неравномерно расширены. Микроворсинки имели средние размеры. Лизосомы разной величины поодиночке или группами располагались в цитоплазме. Как и в группе 1БНД, на третьи сутки наблюдения функциональное состояние тироцитов соответствовало гипофункции (17,50±0,22 балла) и на 24-е сутки восстанавливалось до нормофункции (33,80±0,20 балла).

В группе 2БНД+М прослеживались однонаправленные изменения с аналогичными в группе 1БНД+М. Из особенностей стоит отметить, что активный хроматин занимал преимущественно центральные отделы кариоплазмы, была выявлена клетка с расположением неактивного хроматина в виде «дорожки», встречались лизосомы разного размера с электронно-плотным гетерогенным содержимым, короткие микроворсинки. В поздние сроки эухроматин преобладал в центре ядра с неровными контурами. Определялись круглые, реже овальные, мелкие митохондрии. Оценка функционального состояния тироцитов на электронограммах щитовидной железы крыс группы 2БНД+М показала, что на третьи сутки оно было пониженным, как и в группе 2БНД (15,00±0,15 балла), однако на 24-е сутки восстанавливалось до нормальной функции, в отличие от группы 2БНД (31,10±0,28 балла).

Анализ структурных особенностей тироцитов на электронограммах в группе 1БНД+С выявил положительную динамику, как и в группе 1БНД+М. С учетом общего характера изменений необходимо также отметить выявленные особенности: контуры ядра были волнистые, определялось ядрышко, лизосомы имели разный размер, встречались единичные секреторные гранулы, аутофагосомы и митохондрии с нарушением целостности мембраны (в ранние сроки наблюдения), а также преимущественно овальной формы типичные митохондрии (в поздние сроки наблюдения) (рисунок 1). Гипофункция тироцитов была установлена при оценке их функционального состояния на третьи сутки наблюдения (16,90±0,18 балла) и нормофункция – на 24-е сутки (32,60±0,16 балла).

Рисунок 1. Электронно-микроскопические особенности тироцитов щитовидной железы половозрелых крыс на третьи сутки эксперимента (а – группа 1БНД, б – группа 2БНД, в – группа 1БНД+М, г – группа 2БНД+М, д – группа 1БНД+С, е – группа 2БНД+С): тц – тироцит, я – ядро, гх – гетерохроматин, д – гетерохроматин в виде дорожки, яд – ядрышко, э – гранулярная эндоплазматическая сеть, м – митохондрии, мр – митохондрии с разрушенным участком, л – лизосомы, ау – аутофагосома, сг – секреторные гранулы, мв – микроворсинка, к – капилляр, рфс – рыхло расположенные фибриллярные структуры в полости цистерны гранулярной эндоплазматической сети, фс – концентрически скрученные фибриллярные структуры в полости цистерны гранулярной эндоплазматической сети, а – клетка с признаками апоптоза. Ув.×8000.

Figure 1. Electron microscopic features of mature rat’s thyroid gland thyrocytes on the day 3 of the experiment (a – group 1SBD, b – group 2SBD, c – group 1SBD+M, d – group 2SBD+M, e – group 1SBD+S, f – group 2SBD+S): тц – thyrocyte, я – nucleus, гx – heterochromatin, д – heterochromatin in the form of a lane, яд – nucleolus, э – rough endoplasmic reticulum, м – mitochondria, мр – mitochondria with a destroyed area, л – lysosomes, ay – autophagosome, сг – secretory granules, мв – microvilli, к – capillary, рфс – loosely located fibrillar structures in the cavity of the cistern of the rough endoplasmic reticulum, фс – concentrically twisted fibrillar structures in the cavity of the cistern of the rough endoplasmic reticulum, a – cell with signs of apoptosis. Magnification×8000.

Ультраструктурные изменения в группе 2БНД+С сопоставимы с группой 1БНД+С, но имелись некоторые отличия. Так, в начале наблюдения эухроматин располагался в центральных участках ядра между гетерохроматином. Встречались лизосомы крупных размеров с электронно-плотным гетерогенным содержимым. В полости цистерн гранулярной эндоплазматической сети выявлялись концентрически скрученные фибриллярные структуры. Встречались митохондрии типичного строения, овальные или круглые в сечении, с плотным или частично разрушенным содержимым. К 24-м суткам часть контуров ядра имела вид ямкообразных углублений. Лизосомы на периферии цитоплазмы могли располагаться группами, а в ее центре – поодиночке (рисунок 2). Оценка функционального состояния тироцитов на электронограммах показала, что на третьи и 24-е сутки оно соответствовало гипофункции (13,60±0,16 и 19,30±0,21 балла).

Рисунок 2. Электронно-микроскопические особенности тироцитов щитовидной железы половозрелых крыс на 24-е сутки эксперимента (а – группа 1БНД, б – группа 2БНД, в – группа 1БНД+М, г – группа 2БНД+М, д – группа 1БНД+С, е – группа 2БНД+С): тц – тироцит, я – ядро, гх – гетерохроматин, яд – ядрышко, э – гранулярная эндоплазматическая сеть, м – митохондрии, мр – митохондрии с разрушенным участком, л – лизосомы, сг – секреторные гранулы, к – капилляр, рфс – рыхло расположенные фибриллярные структуры в полости цистерны гранулярной эндоплазматической сети. Ув.×8000.

Figure 2. Electron microscopic features of mature rat’s thyroid gland thyrocytes on the day 24 of the experiment (a – group 1SBD, b – group 2SBD, c – group 1SBD+M, d – group 2SBD+M, e – group 1SBD+S, f – group 2SBD+S): тц – thyrocyte, я – nucleus, гx – heterochromatin, яд – nucleolus, э – rough endoplasmic reticulum, м – mitochondria, мр – mitochondria with a destroyed area, л – lysosomes, сг – secretory granules, к – capillary , рфс – loosely located fibrillar structures in the cavity of the cistern of the rough endoplasmic reticulum. Magnification×8000.

ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно работам исследователей, бензоат натрия вызывает дисбаланс оксидантно-антиоксидантной системы через активацию перекисного окисления липидов, увеличение свободных форм кислорода и ингибирование антиоксидантных ферментов. При этом он способен активизировать процессы апоптоза и увеличивать уровень воспалительных цитокинов – TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6 (последнее по принципу «замкнутого круга» усиливают оксидативный стресс) [9]. Также консервант способен повреждать ДНК [10], цитолемму и внутреннюю мембрану митохондрий, снижать уровень гемоглобина и значение индекса митотического деления [11]. Имеются данные о том, что бензоат натрия снижает уровень Т₃, Т₄ и тиреотропного гормона [12], а также повышает уровень Na⁺ [10]. Длительное употребление бензоата натрия, согласно уже опубликованным данным автора статьи, на ультраструктурном уровне подтверждает зависимое от дозы снижение функции фолликулярных клеток [3]. Далее в ходе эксперимента после двухмесячного использования консерванта наносился дефект в большеберцовых костях. По данным литературы, такое воздействие практически не оказывает влияния на уровень тиреотропного гормона, при этом также уменьшается уровень Т₃ и Т₄ [13]. На фоне гипофункции тироцитов, вызванной бензоатом натрия и травмой, включается механизм «обратной петли» (так как бензоат натрия уже не поступает в организм) и уровень тиреотропного гормона может восстанавливаться или возрастать [14], вызывая гипертрофию тироцитов [15]. В литературе данный факт объясняется несколькими механизмами. Во-первых, считается, что при повреждении плазмолеммы и митохондрий может нарушаться работа Na⁺/K⁺ насоса [16, 17]. Во-вторых, изменения в генетическом материале способствуют синтезу нетипичных тиреоглобулинов, упаковка которых происходит неправильно, с последующим их захватом и накоплением в эндоплазматической сети, что приводит к развитию ее стресса и гипофункции фолликулярных клеток. Этот процесс является обратимым и зависит от природы патологического фактора, его дозы и длительности влияния [14]. Вышеперечисленное позволяет объяснить, что кубическая (реже призматическая) форма клеток обусловлена наличием растянутых канальцев гранулярной эндоплазматической сети в тироцитах (в ее полостях в единичных случаях определяются концентрически скрученные фибриллярные структуры), то есть так называемым ее стрессом, что вместе с низкими микроворсинками, частью митохондрий с разрушенным матриксом, единичными секреторными гранулами и обилием гетерохроматина в ядре морфологически подтверждают гипофункцию клеток в ранние сроки наблюдения. Учитывая динамику положительных изменений, проявляющуюся в большей или меньшей степени на 24-е сутки, по сравнению с контролем (группа КД), можно утверждать, что изменения, вызванные бензоатом натрия, являются обратимыми. Также следует отметить, что ультраструктурные изменения не достигают данных группы сравнения даже в группе 1БНД.

Учитывая механизм действия и нарушения, индуцированные бензоатом натрия, для их сглаживания перед нанесением травмы кости были использованы два корректора – мексидол и селеназа.

При отщеплении протона от 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (первый компонент препарата мексидола) он связывается с перокси- и алкокси- радикалами, нейтрализуя их (антиоксидантная активность). Остаток янтарной кислоты (второй компонент препарата мексидола) способен поддерживать работу сукцинатоксидазного звена цикла Кребса в условиях дефицита кислорода. Препарат также способен повышать активность селен-зависимой-глутатионпероксидазы [18].

Селен входит в состав глутатионпероксидазы, йодтиронин-дейодиназы 1, 2 и 3 типов, а также тиоредоксинредуктазы. Глутатионпероксидаза препятствует накоплению свободных радикалов (фермент антиоксидантной защиты); йодтиронин-дейодиназы 1 и 2 типа может синтезироваться в щитовидной железе и инициирует превращение тироксина в трийодтиронин; йодтиронин-дейодиназы 3 типа синтезируется только глиальными клетками, кожей и плацентой и инактивирует Т₃ и Т₄; тиоредоксинредуктаза восстанавливает тиоредоксин с участием НАДФ+Н⁺, который является донором атомов водорода для восстановительных процессов (в частности для стабилизации внеклеточных белков, содержащих дисульфидные связи, а также восстанавливает ряд биологически активных соединений, в том числе и глутатионпероксидазу) [19, 20]. Данный химический элемент способен контролировать работу генов (CASP-3 и CASP-9), отвечающих за митохондриальный путь самозапрограммированной клеточной гибели [21].

Вышеуказанные механизмы дают возможность объяснить зависимые от дозы менее выраженные изменения в группах с использованием мексидола и селеназы, обусловленные приемом консерванта и сквозным дефектом кости (причем на третьи и 24-е сутки только в группах 1БНД+М и 1БНД+С ультраструктурные признаки приближаются к аналогичным в группе контроля). Оба препарата вызывают однонаправленные электронномикроскопические изменения, позволяющие в разной мере снижать выраженность морфологических проявлений гипофункции тироцитов на протяжении репаративного остеогенеза.

ВЫВОДЫ

1. Шестидесятисуточное введение бензоата натрия и нанесение дефекта в большеберцовых костях ультрамикроскопически проявляется в виде гипофункции тироцитов щитовидной железы крыс на 3 сутки эксперимента. В группе, в которой крысы получали бензоат натрия в дозе 500 мг/кг массы тела до момента моделирования перелома кости, гипофункция тироцитов сменялась нормофункцией на 24 сутки, в то время как при введении данного консерванта в дозе 1000 мг/кг восстановление функционального состояния не наступало.
2. Использование корректоров – мексидола и селеназы – электронно-микроскопически проявляется снижением функции тироцитов на 3 сутки наблюдения, однако к 24 суткам функциональное состояние восстанавливается до нормофункции, особенно в группах, в которых бензоат натрия вводили в дозе 500 мг/кг, что связано со способностью препаратов воздействовать на звенья механизмов действия, как бензоата натрия, так и травмы.

¹ Способ оценки функционального состояния тироцитов щитовидной железы: патент 2808900 Российская Федерация: МПК G01N 33/483 (2006.01) / В.Н. Морозов, В.И. Лузин, Е.Н. Морозова; патентообладатель ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет». №2023111728; заявлено 05.05.2023; опубликовано 05.12.2023. Бюл. №34. URL: https://rcis.bsu.edu.ru/upload/iblock/537/2808900.PDF

² Определение функционального состояния тироцитов на электронограммах: свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2023682025 Российская Федерация / В.Н. Морозов; патентообладатель ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет». №2023681092; заявлено 13.10.2023; зарегистрировано 20.10.2023 в Реестре программ для ЭВМ ФИПС. URL: https://rcis.bsu.edu.ru/rcis/databases/detail.php?ID=798051

About the authors

Vitalii N. Morozov

Author for correspondence.
Email: morozov_v@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0002-1169-4285

PhD, Associate professor, Department of Human Anatomy and Histology

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure 1. Electron microscopic features of mature rat’s thyroid gland thyrocytes on the day 3 of the experiment (a – group 1SBD, b – group 2SBD, c – group 1SBD+M, d – group 2SBD+M, e – group 1SBD+S, f – group 2SBD+S): тц – thyrocyte, я – nucleus, гx – heterochromatin, д – heterochromatin in the form of a lane, яд – nucleolus, э – rough endoplasmic reticulum, м – mitochondria, мр – mitochondria with a destroyed area, л – lysosomes, ay – autophagosome, сг – secretory granules, мв – microvilli, к – capillary, рфс – loosely located fibrillar structures in the cavity of the cistern of the rough endoplasmic reticulum, фс – concentrically twisted fibrillar structures in the cavity of the cistern of the rough endoplasmic reticulum, a – cell with signs of apoptosis. Magnification×8000.

Download (3MB)

Indexing metadata

3. Figure 2. Electron microscopic features of mature rat’s thyroid gland thyrocytes on the day 24 of the experiment (a – group 1SBD, b – group 2SBD, c – group 1SBD+M, d – group 2SBD+M, e – group 1SBD+S, f – group 2SBD+S): тц – thyrocyte, я – nucleus, гx – heterochromatin, яд – nucleolus, э – rough endoplasmic reticulum, м – mitochondria, мр – mitochondria with a destroyed area, л – lysosomes, сг – secretory granules, к – capillary , рфс – loosely located fibrillar structures in the cavity of the cistern of the rough endoplasmic reticulum. Magnification×8000.

Download (3MB)

Indexing metadata