Оценка морфологической структуры децеллюляризованной человеческой амниотической мембраны

Полный текст

Список сокращений

АМ – амниотическая мембрана.

ВВЕДЕНИЕ

Врегенеративной медицине широко применяется один из уникальнейших биоматериалов – это амниотическая мембрана (АМ), образованная монослоем эпителиальных клеток на базальной мембране и стромы, состоящей из трех слоев. Содержащиеся во всех слоях АМ биологически активные вещества обеспечивают активацию регенераторных процессов, пролиферацию клеток, а также ускоряют их миграцию [1–4]. Однако перед применением донорский биоматериал подвергается обязательной предварительной обработке. Прежде всего АМ отмывают от сгустков крови и слизи на ее поверхности. Данные мероприятия являются общепринятыми. Выполняемая далее обработка АМ различными химическими веществами с целью дезинфекции (в данном случае именно дезинфекции!), защиты биоматериала от избыточного повреждения в ходе консервации и последующей консервации по-разному оцениваются исследователями в плане необходимости, эффективности и влияния на сохранность биологически активных веществ в биоматериале [5]. Многие специалисты предпочитают использовать нативную либо криоконсервированную АМ, так как в данных случаях сохраняются жизнеспособными клетки и практически не повреждается анатомическая структура биоматериала [6–9]. Но поскольку нативную АМ хранить невозможно и есть вероятность использования инфицированного материала, методом выбора для использования АМ в регенеративной медицине является криоконсервация.

Однако необходимо отметить, что применение химических веществ при криоконсервации в средах, содержащих глицерин, использование антибактериальных препаратов при дезинфекции, а также замораживание и размораживание могут значительно изменить как структуру, так и жизнеспособность криоконсервированной АМ [9]. Другие распространенные методы консервации АМ, а именно высушивание над силикагелем либо лиофилизация, подразумевают полную потерю жизнеспособности клеточных элементов, децеллюляризацию и возможное нарушение морфологической структуры с сохранением анатомической целостности биоматериала [10, 11], что многие авторы считают одним из важнейших факторов успешного применения при реконструктивных операциях [11–13].

При создании тканеинженерных комплексов исследователи предпочитают в качестве биологической подложки для культивированных клеток децеллюляризованную АМ. Децеллюляризация – это процесс, направленный на удаление клеток из ткани с сохранением внеклеточного матрикса и трехмерности ее структуры [7, 14, 15], с использованием различных методов воздействия на клетки. Все методы децеллюляризации в зависимости от основного воздействующего фактора можно разделить на три типа – физические, химические и биологические. Физические методы присутствуют в большинстве протоколов предварительной обработки ткани. Они подразумевают применение ротаторов, шейкеров или камер прямой перфузии, позволяющих ускорить процесс обмена жидкости, воздействующей на клеточные мембраны, с целью разрушения клеток и их ядер. Но чаще исследователи используют химические агенты – анионное поверхностно-активное вещество додецилсульфат натрия, обладающий способностью денатурировать белки и растворять клеточные мембраны. Также специалисты используют органические кислоты, в частности, периуксусную кислоту, которая разрушает и удаляет нуклеиновые кислоты. Для децеллюляризации биоматериала возможно использование спиртов и хелатирующих агентов [16, 17].

Наиболее простым физическим методом децеллюляризации является процесс многократного замораживания и оттаивания, при котором происходят разрушение клеточных мембран кристаллами льда и соответственно потеря клетками жизнеспособности. Также к физическим методам можно отнести погружение в гипертонический раствор, что приводит к осмотическому стрессу и повреждению мембран клеток [17, 18]. Но наиболее эффективным физическим методом децеллюляризации является ультразвуковое воздействие, поскольку высокая эффективность повреждения клеточных структур звуковой энергией дополняется механическим очищением биоматериала от клеточного мусора [14].

ЦЕЛЬ

Изучение морфологической структуры лиофилизированной амниотической мембраны, предварительно подвергнутой децеллюляризации физическим методом.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Экспериментальное исследование сохранности анатомической структуры лиофилизированной амниотической мембраны было выполнено на четырех группах фрагментов амниотической мембраны. Биоматериал после отмывки в проточной воде от сгустков крови разрезался на фрагменты размером 1х1 см и распределялся на четыре группы. Первая группа – 10 фрагментов – амниотическая мембрана пропитывалась глицерином и помещалась на рамках над силикагелем и осуществлялось высушивание; вторая группа – 12 фрагментов – амниотическая мембрана пропитывалась глицерином и обрабатывалась низкочастотным ультразвуком при частоте 24–40 кГц в ультразвуковой ванне «Сапфир» ТТК (ООО «Сапфир», Москва, Россия) с последующей лиофилизацией; третья группа – 10 фрагментов – амниотическая мембрана обрабатывалась низкочастотным ультразвуком на частоте 24–40 кГц в ультразвуковой ванне «Сапфир» ТТК (ООО «Сапфир», Москва, Россия) и без предварительного пропитывания глицерином подвергалась лиофилизации.

Четвертая (контрольная) группа – 10 фрагментов нативной амниотической мембраны, которые исследовались без дополнительной обработки и консервации.

Лиофилизацию материала (вакуумную сушку сублимацией) проводили с использованием сублимационной установки ALPHA2-4LSC (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Остероде-ам-Харц, Германия).

Морфологические исследования проводились после фиксации биоматериала в 12% нейтральном растворе формалина, проводки через батарею спиртов и заливки в целлоидин. Выполнялось не менее 500 срезов с разных образцов биоматериала. Срезы окрашивались гематоксилин-эозином или пикрофуксином по Ван Гизону. Анализ изображений окрашенных препаратов производили с помощью системы визуализации на основе исследовательского микроскопа Olympus ВX41 (“Olympus”, Япония), цветной цифровой камеры “ProgRes CF” и стационарного компьютера с программным обеспечением «Морфология 5.2» («ВидеоТесТ», Россия).

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) амниотической мембраны после консервации выполнялась с использованием растрового электронного микроскопа JEOLJSM-6390 A Analysis Station (Япония). Для данного исследования фрагменты биоматериала фиксировали 2,5% водным раствором глутарового альдегида, далее осуществляли проводку через батарею спиртов. После проведения через раствор этанола в возрастающей концентрации и сушки при комнатной температуре в течение 24 часов на биоматериал напылялось золото или углерод для улучшения требуемой поверхностной электропроводности при выполнении сканирующей электронной микроскопии.

Полученные результаты обрабатывались статистическими методами пакета SPSS_Statistics.

Работа была выполнена с разрешения комитета по биоэтике Самарского государственного медицинского университета (выписка из протокола №206 от 18 марта 2020 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выбор действующего агента для децеллюляризации нами определен исходя из анатомо-гистологического строения и размеров биоматериала. В частности, низкочастотное ультразвуковое воздействие позволяет удалять элементы крови, а волновое воздействие и кавитация, вероятно, могут повреждать все клеточные структуры амниотической мембраны, поскольку толщина нативного биоматериала не более 0,5 мм. Учитывая, что в настоящее время критерии эффективности децеллюляризации не определены, нами изготавливались морфологические препараты. Мы считаем, что децеллюляризованные донорские органы не должны содержать неповрежденные клетки и клеточные компоненты.

Макроскопически биоматериал всех трех опытных групп был внешне похож на лист папиросной бумаги, эластичный и бархатистый на ощупь. Необходимо отметить, что образцы третьей группы лиофилизированной амниотической мембраны без пропитывания глицерином оказались с более матовой и неоднородной поверхностью, чем образцы первой и второй групп, предварительно пропитанные глицерином.

Морфологический препарат нативной амниотической мембраны демонстрирует полностью сохранный эпителиальный слой с жизнеспособными клетками, множеством пиноцитарных пузырьков (рисунок 1). К базальной мембране прилежит компактный слой, состоящий из плотно переплетенных коллагеновых волокон, слой фибробластов – рыхлый с расположенными в переплетениях ретикулярных волокон фибробластами. Спонгиозный слой представлен нежными, в произвольном порядке переплетенными ретикулярными волокнами.

 

Рисунок 1. Препарат нативной амниотической мембраны. Окраска пикрофуксином. Ув. х400.

Figure 1. Native amniotic membrane preparation. Stained with picrofuchsin. Magnification x400.

 

На гистологических препаратах первой группы – силиковысушенной амниотической мембраны после предварительного пропитывания глицерином – наблюдается практически гомогенная полоса, в которой сложно определить эпителиальный и компактный слои (рисунок 2). Местами визуализируются сильно уплощенные ядра клеток. Компактный слой стромы выглядит как гомогенная бесклеточная оксифильная полоса. Нередко видны тени ядер в слое фибробластов. Ядра сохранившихся фибробластов имеют палочковидную форму. Спонгиозный слой резко уплощен, определяется по разнонаправленным оксифильно окрашенным волокнам. При морфометрии общей толщины препарата (n – 55) лиофилизированной амниотической мембраны с предварительным пропитыванием глицерином получено среднее значение измерений – 6,9184 мкм.

 

Рисунок 2. Препарат амниотической мембраны, консервированной путем высушивания над силикагелем после предварительной обработки глицерином. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х400.

Figure 2. Amniotic membrane preparation preserved by drying over silica gel after preliminary treatment with glycerol. Stained with hematoxylin and eosin. Magnification x400.

 

Растровая электронная микроскопия подтвердила сохранность эпителиального слоя у образцов первой группы (рисунок 3). Эпителиальный пласт, представленный частично поврежденными клетками, прилежит к подлежащему слою на всей поверхности биоматериала. Местами наблюдаются точечные дефекты, ограниченные контурами клеток.

 

Рисунок 3. Электронно-микроскопическое изображение амниотической мембраны в сканирующем электронном микроскопе. Эпителиальная поверхность препарата амниотической мембраны силиковысушенной с предварительным пропитыванием глицерином. Ув. х1000.

Figure 3. Electron microscopic image of the amniotic membrane in a scanning electron microscope. Epithelial surface of the amniotic membrane preparation dried with silica and pre-impregnated with glycerol. Magnification x1000.

 

Растровая электронная микроскопия амниотической мембраны, высушенной над силикагелем со стороны спонгиозного слоя, подтверждает, что значительные изменения происходят в рыхлом соединительнотканном слое стромы, а именно, спонгиозный слой сглаживается. Важно отметить наличие гомогенных бесструктурных субстратов формирующих древовидную форму по ходу разнонаправленных ретикулярных волокон (рисунок 4).

 

Рисунок 4. Электронно-микроскопическое изображение амниотической мембраны в сканирующем электронном микроскопе. Спонгиозный слой препарата амниотической мембраны силиковысушенной с предварительным пропитыванием глицерином. Ув. х400.

Figure 4. Electron microscopic image of the amniotic membrane in a scanning electron microscope. Spongy layer of the amniotic membrane preparation dried with silica and preliminary impregnation with glycerin. Magnification x400.

 

При детальном исследовании гистологических препаратов второй группы четко визуализируется эпителиальный слой (рисунок 5). На единичных участках наблюдается очаговая деструкция эпителиальных клеток. В сохранившихся клетках наблюдаются пикноз ядер и концентрация хроматина в виде конгломератов. Базальная мембрана повреждена на участке очаговой деструкции эпителиальных клеток. Компактный слой местами выглядит как гомогенная бесклеточная оксифильная полоса, местами в нем визуализируются волокна. Спонгиозный слой также сохранен, но уплотнен, потеряна структурная организация. При морфометрии общей толщины препаратов (n – 48) лиофилизированной амниотической мембраны с предварительным пропитыванием глицерином получено среднее значение измерений – 10,236 мкм.

 

Рисунок 5. Препарат амниотической мембраны, консервированной путем лиофилизации после предварительной обработки глицерином. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х400.

Figure 5. Amniotic membrane preparation preserved by lyophilization after preliminary treatment with glycerol. Stained with hematoxylin and eosin. Magnification x400.

 

Сканирующая электронная микроскопия более подробно показала разрушения эпителиального слоя, отсутствие жизнеспособных клеточных структур, повреждения и частичную десквамацию базальной мембраны (рисунок 6).

 

Рисунок 6. Электронно-микроскопическое изображение амниотической мембраны в сканирующем электронном микроскопе. Эпителиальная поверхность препарата лиофилизированной амниотической мембраны с предварительным пропитыванием глицерином. Ув. х50.

Figure 6. Electron microscopic image of amniotic membrane in a scanning electron microscope. Epithelial surface of a lyophilized amniotic membrane preparation with preliminary impregnation with glycerol. Magnification x50.

 

Спонгиозный слой представлен более плотными соединительнотканными волокнами, на которых определяются гомогенные бесструктурные субстраты, прикрепленные гроздями (рисунок 7).

 

Рисунок 7. Электронно-микроскопическое изображение амниотической мембраны в сканирующем электронном микроскопе. Спонгиозный слой препарата лиофилизированной амниотической мембраны с предварительным пропитыванием глицерином. Ув. х400.

Figure 7. Electron microscopic image of amniotic membrane in a scanning electron microscope. Spongy layer of a lyophilized amniotic membrane preparation with preliminary impregnation with glycerol. Magnification x400.

 

Эпителиальный слой на гистологических препаратах третьей группы образцов выглядит уплощенным гомогенным оксифильным слоем (рисунок 8). Наблюдаются единичные конгломераты хроматина разрушенных ядер эпителиальных клеток.

 

Рисунок 8. Препарат амниотической мембраны, консервированной путем лиофильной сушки без обработки глицерином. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х400.

Figure 8. Amniotic membrane preparation preserved by lyophilization without glycerol treatment. Hematoxylin and eosin staining. Magnification x400.

 

Базальная мембрана неравномерной толщины частично отсутствует. Компактный слой имеет уплотненную гомогенную структуру. В слое фибробластов практически отсутствуют клеточные элементы. Единичные ядра разрушенных фибробластов представлены тенями в форме палочек. Конгломератов хроматина нет. Спонгиозный слой уплощен. При морфометрии общей толщины препарата (n – 44) лиофилизированной амниотической мембраны без пропитывания глицерином получено среднее значение измерений – 10,026 мкм.

Сканирующая электронная микроскопия препаратов третьей группы консервированной амниотической мембраны: эпителиальный слой представлен незначительными фрагментами клеточных мембран и базальной мембраной, которая на большей части изучаемой поверхности десквамирована. При большем увеличении базальная мембрана представлена незначительными фрагментами, края которых свернуты и обнажен подлежащий стромальный слой (рисунок 9).

 

Рисунок 9. Электронно-микроскопическое изображение амниотической мембраны в сканирующем электронном микроскопе. Эпителиальная поверхность препарата лиофилизированной амниотической мембраны без предварительного пропитывания глицерином. Ув. х400.

Figure 9. Electron microscopic image of amniotic membrane in a scanning electron microscope. Epithelial surface of a lyophilized amniotic membrane preparation without preliminary impregnation with glycerol. Magnification x400.

 

Спонгиозный слой у данной группы образцов менее всего поврежден. Коллагеновые волокна тонкие, разнонаправленные, рыхло расположенные. На данном препарате четко прослеживается сквозная пористость биоматериала. Необходимо отметить наличие единичных гомогенных образований, прикрепленных к коллагеновым волокнам (рисунок 10).

 

Рисунок 10. Электронно-микроскопическое изображение амниотической мембраны в сканирующем электронном микроскопе. Спонгиозный слой препарата лиофилизированной амниотической мембраны без предварительного пропитывания глицерином. Ув. х1000.

Figure 10. Electron microscopic image of amniotic membrane in a scanning electron microscope. Spongy layer of the preparation of lyophilized amniotic membrane without preliminary impregnation with glycerol. Magnification x1000.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное гистологическое исследование амниотической мембраны показало значительные отличия морфологической картины в зависимости от предварительной (перед консервацией) обработки биоматериала. В тех случаях, когда децеллюляризация не проводилась и применялась методика высушивания над силикагелем, без этапов заморозки биоматериала, визуализировался эпителиальный слой с сохранными ядрами и мембранами клеток.

При изучении фрагментов АМ, подвергнутых процессу децеллюляризации путем воздействия низкочастотным ультразвуком, во второй и третьей группах наблюдаются полное разрушение клеточных структур и почти полное удаление клеточных компонентов. На гистологических препаратах отмечаются полное разрушение клеток эпителиального слоя и частичное повреждение базальной мембраны с обнажением стромы и формированием трабекулярной архитектоники биоматериала. Более выражены данные изменения в препаратах, которые не пропитывались глицерином перед лиофилизацией.

В децеллюляризованной ткани внеклеточный матрикс оставался неизмененным. Набухания либо иных патологических изменений структуры, архитектоники, ориентации волокон, тинкториальных свойств соединительной ткани обнаружено не было.

Следовательно, физические методы воздействия на биологическую ткань ожидаемо оказывают влияние на жизнеспособность клеток и позволяют получить полностью децеллюляризованную амниотическую мембрану. Дополнительная обработка глицерином перед физическим воздействием на биологическую ткань с целью децеллюляризации значительного влияния на сохранность клеточных структур не оказывает. Следует лишь отметить, что в децеллюляризованной лиофилизированной АМ, пропитанной глицерином, больше сохраняется фрагментов мембран эпителиальных клеток и базальная мембрана также более сохранена.

ВЫВОДЫ

Разработанный нами метод децеллюляризации с использованием физических методов не вносит в обрабатываемый биоматериал каких-либо химических веществ, которые могут оказать непредсказуемое воздействие на регенерирующие ткани.

Консервация АМ методом лиофилизации позволяет получить морфологически целостный, эластичный и прочный биоматериал.

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Работа выполнена по инициативе авторов без привлечения финансирования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Соответствие нормам этики. Исследование одобрено комитетом по биоэтике Самарского государственного медицинского университета (выписка из протокола №206 от 18 марта 2020 г.).

Участие авторов. К.Е. Кучук – обработка и консервация биоматериала, подготовка текста. Л.Т. Волова – разработка концепции и дизайна исследования, анализ полученных данных. И.В. Новиков – анализ полученных данных, подготовка текста. Е.С. Милюдин – сбор материала, анализ полученных данных, редактирование текста. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Об авторах

К. Е. Кучук

ГБУЗ «СОКОБ имени Т.И. Ерошевского»

Email: kuchukke@rambler.ru
ORCID iD: 0009-0003-2986-5913

врач-офтальмолог, заведующая отделением заготовки и консервации тканей

Россия, Самара

Л. Т. Волова

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: l.t.volova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-8510-3118

д-р мед. наук, профессор, директор НИИ «БиоТех»

Россия, Самара

И. В. Новиков

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: р111аа@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6855-6828

канд. мед. наук, ассистент кафедры травматологии, ортопедии и экстремальной хирургии имени академика РАН А.Ф. Краснова

Россия, Самара

Евгений Сергеевич Милюдин

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: e.s.milyudin@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-7610-7523

д-р мед. наук, доцент кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии с курсом медицинских информационных технологий

Россия, Самара

Список литературы

Дополнительные файлы