МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗОВАННОЙ ЛИОФИЛИЗРОВАННОЙ АМНИОТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ

Полный текст

В регенеративной медицине широко применяется один из уникальнейших биоматериалов — это амниотическая мембрана, образованная монослоем эпителиальных клеток на базальной мембране и стромы, состоящей из трех слоев. Содержащиеся во всех слоях амниотической мембраны биологически активные вещества обеспечивают активацию регенераторных процессов, пролиферацию клеток, ускоряют миграцию клеток [1, 2, 3, 4]. Однако, исследователи перед применением донорский биоматериал обязательно подвергают предварительной обработке. Прежде всего отмывают от сгустков крови, слизи на поверхности амниотической мембраны и данные мероприятия не оспариваются. Выполняемая далее обработка различными химическими веществами с целью дезинфекции, защиты биоматериала от избыточного повреждения в ходе консервации и последующая консервация по-разному оцениваются исследователями в плане необходимости, эффективности и сохранности биологически активных веществ в амниотической мембране [5]. По этим причинам многие исследователи предпочитают использовать нативную либо криоконсервированную амниотическую мембрану так как в данном случае сохраняются жизнеспособными клетки и практически не повреждается анатомическая структура [6, 7, 8, 9]. Данное обстоятельство позволяет считать криоконсервацию методом выбора для амниотической мембраны.

Однако необходимо отметить применение химических веществ при криоконсервации в средах, содержащих глицерин, использование антибактериальных препаратов при дезинфекции, а также замораживание и размораживание могут значительно изменить как структуру, так и жизнеспособность криоконсервированной амниотической мембраны [9].

Другие распространенные методы консервации АМ высушивание над силикагелем либо лиофилизация подразумевают полную потерю жизнеспособности клеточных элементов и возможное нарушение анатомического строения с сохранением анатомической целостности биоматериала [10, 11], что многие авторы считают одним из важнейших факторов успешного применения при реконструктивных операциях [11, 12, 13].

При создании тканеинженерных комплексов исследователи предпочитают децеллюляризованную амниотическую мембрану в качестве биологической подложки для культивированных клеток. Децеллюляризация – это процесс, направленный на удаление клеток из ткани с сохранением внеклеточного матрикса и трехмерности структуры органа [14, 15], с использованием различных методов воздействия на клетки. Все методы можно разделить на три типа – физические, химические и биологические.

Физический метод присутствует в большинстве протоколов. Это в основном ротаторы, шейкеры или камеры прямой перфузии, позволяющие ускорить процесс обмена жидкости, воздействующей на клеточные мембраны и разрушающей ядра клеток. Но чаще используются химические методы - анионное поверхностно-активное вещество додецилсульфат натрия характеризующийся способностью денатурировать белки и растворять клеточные мембраны. Также используются органические кислоты, в частности, периуксусная кислота разрушает и удаляет нуклеиновые кислоты. Возможно использование для децеллюляризации биоматериала спиртов и хелатирующих агентов [16, 17].

Наиболее простым физическим методом децеллюляризации является процесс многократного замораживания и оттаивания, при котором происходит разрушение мембран кристаллами льда, и соответственно потеря жизнеспособности клеток. К физическим методам можно также отнести погружение в гипертонический раствор, что приводит к осмотическому стрессу и соответственно повреждению мембран клеток [17, 18]. Наиболее эффективным физическим методом децеллюляризации является использование ультразвукового воздействия, поскольку высокая эффективность повреждения клеточных структур еще и дополняется очищением от клеточного мусора [14].

Целью данного исследования явилось изучение морфологической структуры лиофилизированной амниотической мембраны предварительно подвергнутой децеллюляризации физическим методом.

Материал и методы.

Экспериментальное исследование сохранности анатомической структуры лиофилизированной амниотической мембраны было выполнено на четырех группах фрагментов амниотической мембраны. Биоматериал после отмывки в проточной воде от сгустков крови разрезался на фрагменты размером 1х1см и распределялся на 4 группы:

- 1 группа, 10 фрагментов – амниотическая мембрана пропитывалась глицерином и помещалась на рамках над силикагелем и осуществлялось высушивание;

- 2 группа, 12 фрагментов – амниотическая мембрана пропитывалась глицерином и обрабатывалась низкочастотным ультразвуком при частоте 24–40 кГц в ультразвуковой ванне «Сапфир» ТТК (ООО «Сапфир», Москва, Россия) с последующей лиофилизацией;

- 3 группа, 10 фрагментов – амниотическая мембрана обрабатывалась низкочастотным ультразвуком на частоте 24–40 кГц в ультразвуковой ванне «Сапфир» ТТК (ООО «Сапфир», Москва, Россия) и без предварительного пропитывания глицерином подвергалась лиофилизации.

Контрольная группа – 10 фрагментов нативной амниотической мембраны, которые исследовались без дополнительной обработки и консервации.

Лиофилизацию материала (вакуумную сушку сублимацией) проводили с использованием сублимационной установки ALPHA2-4LSC (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Остероде-ам-Харц, Германия).

Морфологические исследования проводились после фиксации биоматериала в 12% нейтральном растворе формалина, проводки через батарею спиртов и заливки в целлоидин. Выполнялось не менее 500 срезов с разных образцов биоматериала. Срезы окрашивались гематоксилин-эозином или пикрофуксином по Ван Гизону. Анализ изображений окрашенных препаратов производили с помощью системы визуализации на основе исследовательского микроскопа Olympus ВX41 («Olympus», Япония), цветной цифровой камеры «ProgRes CF» и стационарного компьютера, с программным обеспечением «Морфология 5.2» («ВидеоТесТ», Россия).

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) амниотической мембраны после консервации выполнялась с использованием растрового электронного микроскопа JEOLJSM-6390 A Analysis Station (Япония). Для данного исследования фрагменты биоматериала фиксировали 2,5% водным раствором глутарового альдегида, далее осуществляли проводку через батарею спиртов. После проведения через раствор этанола в возрастающей концентрации и сушки при комнатной температуре в течение 24 часов на биоматериал напылялось золото или углерод для улучшения требуемой поверхностной электропроводности при выполнении сканирующей электронной микроскопии.

Полученные результаты обрабатывались статистическими методами пакета SPSS_Statistics.

Работа была выполнена с разрешения Комитета по биоэтике Самарского государственного медицинского университета (Выписка из протокола №206 от 18 марта 2020г.).

Результаты.

Выбор действующего агента для децеллюляризации нами определен исходя из анатомо-гистологического строения и размеров биоматериала. В частности, низкочастотное ультразвуковое воздействие позволяет удалять элементы крови, а также волновое воздействие и кавитация вероятно может повреждать все клеточные структуры амниотической мембраны, так как толщина нативного биоматериала не более 0,5мм. Учитывая, что в настоящее время не определены критерии эффективности децеллюляризации нами изготавливались морфологические препараты, так как мы считаем, что децеллюляризованные донорские органы не должны содержать неповрежденные клетки и клеточные компоненты.

Макроскопически биоматериал всех трех опытных групп выглядел похожим на лист папиросной бумаги, эластичный и бархатистый на ощупь. Необходимо отметить, что образцы 3 группы лиофилизированной амниотической мембраны без пропитывания глицерином оказались с более матовой и неоднородной поверхностью, чем образцы 1 и 2 групп, предварительно пропитанные глицерином.

Морфологический препарат нативной амниотической мембраны представленный на Рис.1 демонстрирует полностью сохранный эпителиальный слой с жизнеспособными клетками, множеством пиноцитарных пузырьков (Рис.1.). К базальной мембране прилежит компактный слой, состоящий из плотно переплетенных коллагеновых волокон, слой фибробластов рыхлый с расположенными в переплетениях ретикулярных волокон фибробластами. Спонгиозный слой представлен нежными в произвольном порядке переплетенными ретикулярными волокнами.

На гистологических препаратах 1 группы – силиковысушенной амниотической мембраны после предварительного пропитывания глицерином (Рис.2.) наблюдается практически гомогенная полоса, в которой сложно определить эпителиальный и компактный слои. Местами визуализируются сильно уплощенные ядра клеток. Компактный слой стромы выглядит как гомогенная бесклеточная оксифильная полоса. Нередко видны тени ядер в слое фибробластов. Ядра сохранившихся фибробластов имеют палочковидную форму. Спонгиозный слой резко уплощен, определяется по разнонаправленным оксифильно окрашенным волокнам. При морфометрии общей толщины препарата (n - 55) лиофилизированной амниотической мембраны с предварительным пропитыванием глицерином получено среднее значение измерений - 6,9184 мкм.

Растровая электронная микроскопия подтвердила сохранность эпителиального слоя у образцов 1 группы (Рис.3). Эпителиальный пласт, представленный частично поврежденными клетками, прилежит к подлежащему слою на всей поверхности биоматериала. Местами наблюдаются точечные дефекты, ограниченные контурами клеток.

Растровая электронная микроскопия амниотической мембраны, высушенной над силикагелем со стороны спонгиозного слоя подтверждает, что значительные изменения происходят в рыхлом соединительнотканном слое стромы. А именно, спонгиозный слой сглаживается. Важно отметить наличие гомогенных бесструктурных субстратов формирующих древовидную форму по ходу разнонаправленных ретикулярных волокон (Рис.4.).

При детальном исследовании гистологических препаратов 2 группы–(Рис.5) четко визуализируется эпителиальный слой. На единичных участках наблюдается очаговая деструкция эпителиальных клеток. В сохранившихся клетках наблюдается пикноз ядер, и концентрация хроматина в виде конгломератов. Базальная мембрана повреждена на участке очаговой деструкции эпителиальных клеток. Компактный слой местами выглядит как гомогенная бесклеточная оксифильная полоса, местами в нем визуализируются волокна. Спонгиозный слой также сохранен, но уплотнен, потеряна структурная организация. При морфометрии общей толщины препаратов (n - 48) лиофилизированной амниотической мембраны с предварительным пропитыванием глицерином получено среднее значение измерений - 10,236 мкм.

Сканирующая электронная микроскопия более подробно показала разрушения эпителиального слоя, отсутствие жизнеспособных клеточных структур, повреждения и частичную десквамацию базальной мембраны.

Спонгиозный слой представлен более плотными соединительнотканными волокнами, на которых определяются гомогенные бесструктурные субстраты, прикрепленные гроздями (Рис.7).

Эпителиальный слой на гистологических препаратах 3 группы образцов (Рис.8.) выглядит уплощенным гомогенным оксифильным слоем. Наблюдаются единичные конгломераты хроматина разрушенных ядер эпителиальных клеток.

Базальная мембрана неравномерной толщины, частично отстутствует. Компактный слой имеет уплотненную гомогенную структуру. В слое фибробластов практически отсутствуют клеточные элементы. Единичные ядра разрушенных фибробластов представлены тенями в форме палочек. Конгломератов хроматина нет.  Спонгиозный слой уплощен. При морфометрии общей толщины препарата (n - 44) лиофилизированной амниотической мембраны без пропитывания глицерином получено среднее значение измерений - 10,026мкм.

Сканирующая электронная микроскопия препаратов 3 группы консервированной амниотической мембраны эпителиальный слой представлен незначительными фрагментами клеточных мембран и базальной мембраной которая на большей части изучаемой поверхности десквамирована. При большем увеличении базальная мембрана представлена незначительными фрагментами, края которых свернуты и обнажен подлежащий стромальный слой (Рис. 9).

Спонгиозный слой у данной группы образцов менее всего поврежден. Коллагеновые волокна тонкие разнонаправленные, рыхло расположенные. На данном препарате четко прослеживается сквозная пористость биоматериала. Необходимо отметить наличие единичных гомогенных образований, прикрепленных к коллагеновым волокнам (Рис.10).

 

Обсуждение.

Проведенное гистологическое исследование амниотической мембраны показало значительные отличия морфологической картины в зависимости от предварительной, перед консервацией, обработки биоматериала. В тех случаях, когда не проводилась децеллюляризация и применялась методика высушивания над силикагелем, без этапов заморозки биоматериала, визуализировался эпителиальный слой с сохранными ядрами и мембранами клеток.

При изучении фрагментов АМ подвергнутых процессу децеллюляризации путем воздействия низкочастотным ультразвуком в группах 2, 3 наблюдается к полное разрушение клеточных структур и почти полное удаление клеточных компонентов. На гистологических препаратах отмечается полное разрушение клеток эпителиального слоя и частичное повреждение базальной мембраны с обнажением стромы и формированием трабекулярной архитектоники биоматериала.

Более выражены данные изменения отмечаются в препаратах, которые не пропитывались глицерином перед лиофилизацией.

В децеллюляризованной ткани внеклеточный матрикс оставался неизмененным (рис. 10). Набухания либо иных патологических изменений структуры, архитектоники, ориентации волокон, тинкториальных свойств соединительной ткани обнаружено не было.

Следовательно, физические методы воздействия на биологическую ткань ожидаемо оказывают влияние на жизнеспособность клеток и позволяют получить полностью децеллюляризованную амниотическую мембрану. Дополнительная обработка глицерином перед физическим воздействием на биологическую ткань с целью децеллюляризации значительного влияния на сохранность клеточных структур не оказывает. Следует только отметить, что в децеллюляризованной лиофилизированной амниотической мембране, пропитанной глицерином, больше сохраняется фрагментов мембран эпителиальных клеток и более сохранна базальная мембрана.

Выводы.

Разработанный нами метод децеллюляризации с использованием физических методов не вносит в обрабатываемый биоматериал каких-либо химических веществ, которые могут оказать непредсказуемое воздействие на регенерирующие ткани.

Консервация амниотической мембраны методом лиофилизации позволяет получить морфологически целостный, эластичный и прочный биоматериал.

 

Об авторах

Ксения Евгеньевна Кучук

Самарская областная клиническая офтальмологическая больница имени Т.И.Ерошевского

Автор, ответственный за переписку.
Email: kuchukke@rambler.ru
ORCID iD: 0009-0003-2986-5913

заведующая отделением заготовки и консервации тканей

Россия, 443058 Россия, Самара, ул.Ново-Садовая, 158

Лариса Теодоровна Волова

Биотехнологический центр «Биотех» СамГМУ

Email: l.t.volova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-8510-3118

профессор, доктор медицинских наук

Россия, Самара

Евгений Сергеевич Милюдин

кафедра Оперативной хирургии и клинической анатомии с курсом медицинских информационных технологий

Email: e.s.milyudin@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-7610-7523

доктор медицинских наук, заведующий отделением 

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы