Pathogenetic significance of CD3+CD56+ T-lymphocytes in hemorrhagic fever with renal syndrome

Full Text

ГЛПС – геморрагическая лихорадка с почечным синдромом; ЦТЛ – цитотоксические лимфоциты; НК – натуральные киллеры; НКТ – НК-подобные Т-лимфоциты.

ВВЕДЕНИЕ

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) вызывается хантавирусами и относится к категории зоонозных инфекций природно-очагового характера, распространенных по всему миру [1]. На территории Российской Федерации заболевание этой этиологии связано с определенными вариантами хантавируса, среди которых чаще всего регистрируются Puumala, Hantaan, Seоul, Amur, Dobrava [2, 3]. Наиболее крупный природный очаг ГЛПС в РФ локализуется в Приуралье и Среднем Поволжье, где проводилось данное исследование, основным возбудителем в этом регионе является тип Puumala, а природным резервуаром служит грызун европейская рыжая полевка [4, 5].

Актуальность проблемы ГЛПС связана с генерализованным характером инфекции, многообразиeм клинических вариантов от абортивных лихорадочных форм до тяжелых форм с геморрагическим синдромом и стойкой почечной недостаточностью, возможностью летального исхода, длительностью резидуальных явлений при выздоровлении [2, 3, 6, 7]. При этом в клиническом течении ГЛПС выделяют следующие периоды: (1) инкубационный (2–4 недели), (2) начальный (1–3-й день болезни), (3) олигурический (4–11-й день болезни) с развитием острой почечной недостаточности, (4) полиурический период (12–30-й день болезни), (5) период реконвалесценции (2 месяца и более) [3].

Хантавирусы представляют собой одноцепочечные РНК-вирусы, в составе РНК которых выделяют три сегмента (S, M, L), кодирующие нуклеопротеин (N), гликопротеины (Gn и Gc) и РНК-зависимую РНК-полимеразу соответственно [1]. За присоединение хантавирусов к поверхности чувствительных клеток ответственны гликопротеины вирусной оболочки Gn и Gc, которые являются антигенными мишенями нейтрализующих антител и способствуют проникновению вируса внутрь клетки [8]. Нуклеопротеин (N), распознаваемый цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ) человека, полифункционален и участвует в упаковке генома вируса, сопровождении РНК, внутриклеточном транспорте вирусных белков, а также способствует деградации ДНК клетки-мишени, вмешивается в процессы трансляции и ограничивает иммунный ответ хозяина [9].

При ГЛПС у человека хантавирусы поражают сосудистые эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки почечных канальцев, нейтрофилы, мононуклеарные фагоциты, дендритные клетки [7], не оказывая при этом цитопатического эффекта [10]. Как следует из этого перечня, при хантавирусных инфекциях страдают в первую очередь функции клеток врожденного иммунитета миелоидного ряда, при этом осуществление основных защитных реакций с начала развития заболевания будет приходиться на долю лимфоцитов врожденного иммунитета. Cреди клеток крови это прежде всего натуральные киллеры (НК) и подобные натуральным киллерам Т-лимфоциты (НКТ) [11].

Значение натуральных киллеров при ГЛПС подчеркивается многими исследователями. В частности, было показано, что инфицированные хантавирусами клетки проявляют устойчивость к цитолизу натуральными киллерами, поскольку хантавирусы обладают способностью ослаблять их апоптоз и индуцировать у них экспрессию молекул НLA I класса [12], подавляющих активность натуральных киллеров через ингибирующие рецепторы [11]. Кроме того, отмечено, что хантавирусы могут снижать активность таких ферментативных белков, как гранзим В и каспаза-3, определяющих цитотоксические свойства этих лимфоцитов [13]. Однако в этой ситуации менее защищенными от цитотоксического воздействия активированных НК остаются неинфицированные клетки, что усугубляет клинические проявления болезни [12].

В то же время сведений о патогенетической роли НКТ при данном заболевании мы в доступной литературе не встретили.

ЦЕЛЬ

Оценка патогенетического значения НКТ при ГЛПС.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования послужили 65 пациентов с ГЛПС, которые находились на стационарном лечении в первом инфекционном отделении Клиник Самарского государственного медицинского университета, а также 15 здоровых людей контрольной группы. Все они подписали информированное добровольное согласие об участии в исследовании.

Верификация диагноза ГЛПС проводилась серологическим методом в реакции непрямой иммунофлуоресценции с парными сыворотками. В обеих группах было 40% мужчин, средний возраст больных составлял 41,9 ± 12,5 года, здоровых – 45,1 ± 6,1 года.

Всем больным в разные периоды заболевания выполнялся клинический анализ крови на гематологическом анализаторе фирмы BECMAN-COULTER (USA), проточная цитофлуориметрия на приборе BD FACS Canto II (Becton Dickinson, USA) с использованием заданного набора моноклональных антител производства (BD Biosciences, США), иммуноферментный анализ сыворотки крови с использованием планшетного фотометра OPSYS MR (THERMOLABSYSTEMS, Финляндия) для раздельного определения цитокинов в соответствии с инструкцией по применению аппаратуры и комплектов соответствующих моноклональных антител производства фирмы «Вектор Бест» (Россия).

Проводилось тестирование процентного содержания в крови среди лимфоцитов: В-лимфоцитов – CD19+; Т-лимфоцитов – CD3+; Т-хелперов – CD3+CD4+; цитотоксических Т-лимфоцитов, или ЦТЛ – CD3+CD8+; натуральных киллеров, или НК – CD3-CD16+CD56+; НК-подобных Т-лимфоцитов – CD3+CD56+; а также Т-лимфоцитов, экспрессирующих активирующий рецептор CD25 – CD3+CD25+, ЦТЛ, экспрессирующих активирующий рецептор NKG2D – CD3+CD8+CD314+; регуляторных Т-клеток – CD3+FoxP3+. Из показателей гемограммы в исследовании использовалось процентное содержание среди лейкоцитов крови нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов. Устанавливалось содержание в крови провоспалительных цитокинов – интерлейкина (ИЛ)-1β, ИЛ-6, ИЛ-12, факторов некроза опухолей α и β (ФНОα и ФНОβ), интерферона γ (ИФНγ), а также противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10).

Cтатистическая обработка данных проводилась на основе пакета статистических программ SPSS, версия 23.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение содержания в крови НКТ в разные периоды ГЛПС по сравнению с контролем показало следующие результаты. В контрольной группе здоровых лиц медиана [минимум; максимум] числа этих клеток в крови составляла 3,4 [2, 3; 5] %. В лихорадочный период в группе больных ГЛПС число НКТ было несколько меньшим, но достоверно от контроля не отличалось – 2,8 [2, 5; 3, 1] %. В олигоурический период процентное содержание НКТ среди лимфоцитов крови приобретало некоторую тенденцию к повышению – 4,7 [1, 7; 30, 6] %, а в полиурический период эта тенденция приобрела характер достоверного роста (5,6 [1; 17, 5] %) и в 1,6 раза превышала контрольные значения, в период реконвалесценции это нарастание становилось еще более значительным, а процентное содержание НКТ среди лимфоцитов крови составляло 6,2 [3, 7; 8] %.

Динамика изменения содержания этих клеток в крови в процентах отклонения от контроля представлена на рисунке 1.

 

Рисунок 1. Проценты отклонения от контроля содержания в крови НКТ в разные периоды ГЛПС.

 

Для определения патогенетического значения НКТ далее устанавливались корреляционные взаимосвязи этих клеток с лимфоцитами других фенотипов, моноцитами, нейтрофилами с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Результаты такого анализа с обозначением статистически достоверных корреляций представлены на рисунке 2.

 

Рисунок 2. Достоверные корреляционные взаимосвязи клеток врожденного иммунитета с лимфоцитами различных фенотипов и цитокинами в полиурический период и период реконвалесценции при ГЛПС.

 

Как следует из рисунка 2, при ГЛПС все клетки врожденного и адаптивного иммунитета, кроме CD3+CD25+, в полиурический период и период реконвалесценции оставались тесно связанными между собой достоверными корреляционными связями. Что касается НКТ, то их участие в составе корреляционных пар было довольно значительным. Для них были характерны прямые корреляции с другими клетками врожденного иммунитета, такими как моноциты и натуральные киллеры, а также с клетками адаптивного иммунного ответа. С Т-хелперами у НКТ корреляция отрицательная, а вот с цитотоксическими Т-лимфоцитами эти клетки были связаны прямой корреляционной связью, причем речь идет, судя по корреляциям, прежде всего о ЦТЛ, экспрессирующих активирующий рецептор NKG2D.

Что касается взаимосвязи с цитокиновым профилем крови, то для НКТ была характерна отрицательная связь с ИЛ-4 и положительные корреляции с цитокинам клеточных иммунных реакций ИЛ-12 и ИФНγ, а также с цитокином иммуносупрессорного и противовоспалительного действия ИЛ-10.

В связи с этим следует подчеркнуть, что большинство тестированных цитокинов (кроме ИЛ-1β и ИЛ-4) показывали достоверный рост на протяжении всего заболевания, а цитокины, принимающие участие в развитии иммунных реакций клеточного типа, оставались на высоком уровне даже в период реконвалесценции: ИЛ-12 – 12,8 пг/мл, ИФНγ – 117,5 пг/мл, ФНОα – 3,4 пг/мл, ФНОβ – 53 пг/мл, что более чем в 1,5–2 раза превышало контрольные значения и совпадало с наличием корреляционных связей между ними и НКТ (ИЛ-12, ИФНγ, ФНОα).

ОБСУЖДЕНИЕ

НКТ, имеющие фенотип CD3+CD56+, являются уникальной категорией клеток иммунной системы, объединяющей в себе одновременно свойства клеток и врожденного и адаптивного иммунитета. Это связано с тем, что НКТ (как и все Т-лимфоциты) несут специфический рецептор, но репертуар распознаваемых им антигенов чрезвычайно узок и позволяет им реагировать только на микробные гликолипиды определенной структуры, в том числе и при вирусных инфекциях. Следствием такого распознавания служит быстрое высвобождение большого количества цитокинов и хемокинов [14]. Презентация гликолипидов для НКТ осуществляется преимущественно дендритными клетками с участием особой категории молекул гистосовместимости I класса на их поверхности – CD1d. В то же время возможна активация НКТ и в отсутствие гликолипидных антигенов – с участием цитокинов [15].

По механизму индукции НКТ принято делить на 2 категории – CD1d-рестриктированные, представленные как в крови, так и различных органах и тканях организма, и МR1-рестриктированные НКТ, представленные преимущественно в слизистых оболочках барьерных тканей [16.]. В наших исследованиях, в которых объектом изучения служила кровь, речь идет преимущественно о первой категории – СD1d-рестриктированных НКТ, механизм вовлечения которых в иммунный процесс описан выше. Однако необходимо подчеркнуть, что нарастание содержания этих клеток в крови при ГЛПС происходило только с начала полиурического периода, то есть при переходе к разрешающим этапам заболевания, тогда как при других инфекционных процессах НКТ формируют первую линию защиты от вторжения патогенов, а далее лишь усиливают последующий врожденный и адаптивный иммунный ответ [15].

Детальный анализ литературы, посвященной в основном результатам экспериментальных исследований, позволил высказать новую гипотезу по поводу роли НКТ в патогенезе ГЛПС. В наших предыдущих публикациях анализировался феномен нарастания на ранних этапах ГЛПС содержания в крови цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих активирующий лектиновый рецептор NKG2D, который в соответствии с механизмом активации может приводить к формированию пула CD8+ Т-лимфоцитов памяти [17]. Имеются также сведения, не имеющие отношения к хантавирусным инфекциям, что активация CD8+ Т-клеток памяти при избытке вирусных антигенов может стимулировать трансформацию этих клеток в НКТ [18], способные продуцировать ИЛ-12, поддерживающий пул Т-клеток памяти [19]. Эти сведения не противоречат нашим данным об относительно позднем нарастании числа этих клеток при ГЛПС и сохранением в этот период высокого уровня корреляционных связей, в том числе с ИЛ-12.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время патогенетическое значение субпопуляции НКТ (CD3+CD56+) при ГЛПС остается неизвестным. Особенностью реакции НКТ на эту хантавирусную инфекцию послужило их нарастание в крови во второй половине клинических проявлений острого инфекционного процесса. Анализ корреляционных связей НКТ с другими компонентами иммунной системы в этот период позволил выдвинуть гипотезу о встроенности этих клеток в реакции формирования и активации CD8+ Т-клеток памяти как важнейшего протективного механизма при ГЛПС.

Конфликт интересов: все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

About the authors

Mikhail F. Ivanov

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: m.f.ivanov@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2528-0091

PhD, Associate professor, Department of General and Clinical Microbiology, Immunology and Allergology

Russian Federation, Samara

Dmitrii Yu. Konstantinov

Samara State Medical University

Email: d.u.konstantinov@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-6177-8487

PhD, Associate professor, Head of the Department of Infectious Diseases with Epidemiology

Russian Federation, Samara

Irina P. Balmasova

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: iri.balm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8194-2419

PhD, Professor, Head of the Laboratory of Infectious Diseases Pathogenesis and Treatment Methods

Russian Federation, Moscow

Alina Yu. Ulitina

Samara State Medical University

Email: a.ju.ulitina@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-0452-2781

assistant of the Department of Infectious Diseases with Epidemiology

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files