Fibroblasts as the subject of proliferative activity research in vitro

Full Text

АТФ – аденозинтрифосфат;

МДГ – малатдегидрогеназа.

 

Фибробласты – это клетки, которые синтезируют и интегрируют структурные белки, такие как коллаген и эластин, во внеклеточный матрикс большинства тканей мезенхимального происхождения [1, 2]. Для фибробластов характерна экспрессия маркеров, включающих в себя виментин и проколлаген Iá2 цепи [3].

Соединительнотканный каркас сердца [4], легких [5], желудочно-кишечного тракта [6], мышц и других органов содержат фибробласты, выполняющие специализированные функции [8]. Показаны различия в экспрессии генов между фибробластами дермы и дериватов кожи [9, 10], фибробласты, полученные из различных анатомических участков, имеют тканеспецифические цитофизиологические отличия [11]. Кроме того, существуют значительные отличия в архитектонике дермы разных участков тела, которые определяют регенеративный потенциал ткани и влияют на возникновение и характер патологических процессов, например, образование келоидных рубцов [12]. Различия морфофункционального состояния культивируемых фибробластов, полученных из разных участков тела, коррелируют с различной экспрессией гомеобоксных генов Хокса (HОХ-генов), что отражает различные направления местной дифференцировки. Таким образом, биологические свойства фибробластов, полученных из разных участков тела, скорее всего, отражают сочетание эндогенных особенностей и роль таких факторов, как механическое напряжение, которое разнится между топографическими областями [13].

Последние исследования подтверждают концепцию, что перициты – фибробласты, связанные с кровеносными сосудами, – являются разновидностью мезенхимальных стволовых клеток in vivo. Перициты ассоциируются и окружают сосудистые каналы в большинстве тканей. Для идентификации перицитов предложен ряд маркеров, в том числе NG2 и RGS5 [14]. Специ-фическая подгруппа перицитов, экспрессирующих ADAM12, присутствующих в коже и мышцах, активируется в результате ранения и способствует избыточной выработке коллагена в рубце [15].

Фибробласты сердца составляют большую популяцию клеток в этом органе, перемежаясь с кардиомиоцитами. Признано, что воздействие сигналов ангиотензина II на сердечные фибробласты и миоциты приводит к гипертрофии и фиброзу [4]. Воспалительная сигнализация IL-1â и TNF-á также приводит к патологическим изменениям в синтезе коллагена сердечными фибробластами, сопровождающим сердечную недостаточность.

Представленные выше различия обусловлены особенностями анатомического происхождения фибробластов, вместе с тем эти клетки, выделенные из одного типа тканей, также могут иметь разный функциональный потенциал. Например, фибробласты кортикальной и медуллярной зон почек проявляют различия в культуре клеток и в их реакции на митогенную стимуляцию [16].

К внешним факторам, определяющим судьбу фибробласта, относят контакт с клеткой, секретируемые сигнальные факторы и взаимодействие со стромальными элементами. Эксперименты на культуре клеток показывают, что кератиноциты стимулируют фибробласты производить ряд цитокинов, включая ИЛ-6 и FGF7. ИЛ-1 был идентифицирован как индуцирующий фактор в этих экспериментах при сокультивировании клеток [17]. И наоборот, факторы, секретируемые фибробластами, влияют на рост и дифференциацию кератиноцитов, что указывает на реципрокное взаимодействие клеток. Фибробласты, культивируемые как монослой, демонстрируют различия в экспрессии и морфологии коллагена по сравнению с фибробластами в трехмерной культуре. Также наблюдаются различия между коллагеном и фибриновыми гелями [18].

Что касается специфических факторов, вовлеченных в регуляцию фибробластов, то складывающаяся картина представляет собой сложное взаимодействие множества сигнальных путей, которые синергетически регулируют идентичность и функцию фибробластов. Ингибирование сигнального пути Wnt/â-катенин в эпидермисе нарушает адипогенез [19]. Интересно, что последствия активации этого пути специфичны для разных подтипов фибробластов. Стабилизация â-катенина в дермальных фибробластах в процессе развития приводит к фиброзу и нарушает адипогенез [20].

Дисрегуляция сигнализации Wnt наблюдается при ряде состояний, характеризующихся аберрантным или чрезмерным фиброзом. Профиброзные эффекты TGF-â опосредуются через каноническую сигнализацию Wnt путем снижения экспрессии антагониста Wnt Dickkopf-1 [21]. Этот путь также вовлечен в развитие почечного фиброза [22], идиопатического фиброза легких [23].

Фибробласты играют важную роль в поддержании структурной целостности дермы. Для выполнения этой функции должен существовать механизм, при помощи которого эти клетки адаптируются к механическим нагрузкам и реагируют на них. Сигнализация YAP через путь Hippo вовлечена в регулирование жесткости клеточного матрикса [24]. Кроме того, была продемонстрирована роль сигнализации фокальной киназы адгезии в реакциях раны на механическое напряжение.

Старение связано с характерными изменениями в структуре дермы, в том числе с утончением и выравниванием эпителиально-дермального соединения, с потерей эпидермальных гребней [25]. Интересно, что это преимущественно влияет на папиллярную дерму: изменения в поведении папиллярных фибробластов дермы, полученных от пожилых доноров, наблюдались в трехмерных культурах [26]. Изменения также заметны и в других компонентах кожи, таких как крупные кровеносные сосуды.

В эксперименте показано, что в коже пролиферация фибробластов происходит во время эмбрионального развития мыши; однако последующий рост животного не связан с дальнейшей пролиферацией фибробластов, а достигается простым увеличением объема матрикса между соседними фибробластами [27]. Это согласуется с наблюдением, что скорость деления фибробластов в дерме взрослого человека в обычном состоянии очень низкая. Вероятно, во время старения количества фибробластов у взрослого человека недостаточно для поддержания структурной целостности матрикса. С другой стороны, возможно, что в составе подтипов фибробластов дермы наблюдаются возрастные изменения.

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА КУЛЬТУРЫ ФИБРОБЛАСТОВ

Культивированные фибробласты могут удовлетворять свои энергетические потребности для поддержания роста главным образом за счет использования анаэробного гликолиза и в ограниченной степени за счет использования окисления глютамина. Клетки в культуре проходят через две фазы. Первоначально они получают энергию из анаэробного гликолиза, преобразуя большую часть глюкозы среды в молочную кислоту. Лактат вырабатывается в эту начальную фазу роста с коэффициентом 1,6 нмоль на моль глюкозы. Замена культуральной среды и удаление накопленного лактата восполняют глюкозу, что приводит к более быстрому ее усвоению. Утилизация лактата при исчерпании глюкозы происходит только потому, что нет доступных гексозных субстратов [28].

Таким образом, рост в неизмененной среде свидетельствует о быстрой гликолитической фазе при пролиферации клеток и окислительной фазе при сплошном росте. Утилизация глюкозы может быть снижена достаточно заметно при добавлении 10 мМ лактата и 0.5 мМ пирувата. Эффект этих трехуглеродных субстратов заключается в обеспечении энергии за счет их окисления в цикле трикарбоновых кислот. Добавление ингибиторов дыхания не влияет на скорость утилизации глюкозы, что свидетельствует об отсутствии окислительного метаболизма, когда пируват и лактат присутствуют в низких концентрациях.

Способность клеток использовать глюкозу снижается по мере того, как они переходят в фазу сплошного роста. При добавлении к фибробластам инсулина или эпидермального фактора роста возникающий в результате этого стимул сопровождается одновременным повышением скорости гликолиза и активности фосфофруктокиназы [29, 30].

Снижение утилизации глюкозы, наблюдаемое в растущих культурах при достижении сплошного роста, вероятно, связано с сочетанием двух причин. Во-первых, снижение роста клеток и оборота АТФ создают меньшую потребность на синтез АТФ при помощи гликолиза. Во-вторых, увеличение концентрации лактата заставляет окислительный метаболизм играть более заметную роль в синтезе АТФ, тем самым замедляя анаэробное превращение глюкозы.

При изучении клеточных культур необходимо учитывать общий метаболический статус используемых клеток in vitro, относительную интенсивность различных метаболических процессов, а также изменения, вызванные исследуемыми факторами. В одном из исследований методом газовой хроматографии был проанализирован метаболитный состав среды фибробластов [31]. Данное исследование проводилось в течение 31 недели, показатели изучались в динамике, были выявлены значительные количественные отличия, наблюдаемые на хроматограммах. Это наглядно показывает, что клеточный метаболизм является динамическим процессом, подверженным влиянию различных факторов: сывороточного состава, сезонных изменений окружающей среды и т.д.

Общее количество пиков в масс-хроматограммах составило 110. Выявлены 11 метаболитов. Выявление аланина в образцах свидетельствует о значительном увеличении его содержания в среде в результате роста клеток, так как экстрагируемость аминокислот этилацетатом низка. Поскольку выделение аланина характерно для различных пулов клеток животных и человека, активность этого процесса должна постоянно превышать собственные потребности клетки. Поскольку аланин не является конечным продуктом метаболизма, его избыточное производство клетками должно, по всей вероятности, служить некоторому внеклеточному процессу, связанному с существованием клеток в организме. Глюкозно-аланиновый цикл может быть таким процессом: синтезированный аланин, особенно в мышечной ткани, поступает в печень, где он используется для синтеза глюкозы. Затем глюкоза переносится в другие ткани.

При культивировании клеток концентрация молочной кислоты может увеличиваться в 10–18 раз в сравнении с контрольной средой. Выделение сравнительно большого количества молочной кислоты свидетельствует о высокой активности процессов анаэробного гликолиза при выращивании фибробластов.

В то время как содержание многих метаболитов изменялось в среде, присутствие лимонной кислоты характеризовалось стабильностью. Однако ее концентрация была примерно на уровне других метаболитов. Это, вероятно, указывает на то, что активность процессов цикла Кребса в дермальных фибробластах in vitro ниже, чем анаэробный гликолиз.

Выделение холестерина фибробластами показывает, что его синтез из ацетил-КоА превышает внутриклеточные требования. Как и аланин, холестерин, возможно, вырабатывается фибробластами в соответствии с генетически детерминированной программой клеточного метаболизма in vivo.

Выделение фибробластами гидроксиэтилового эфира пальмитиновой кислоты представляет особый интерес с точки зрения эндогенного происхождения этанола, обсуждаемого в настоящее время в литературе.

Даже самая поверхностная интерпретация полученных данных позволяет предположить, что метаболиты, выделяемые фибробластами, in vitro отражают активность определенных процессов в клетках in vivo.

ВЛИЯНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ФИБРОБЛАСТОВ

Ограничение калорий является научно доказанным методом задержки старения у широкого круга видов, включая человека [32], подчеркивающим важность энергетического метаболизма как ключевого регулятора старения. Имеются убедительные данные, подтверждающие мнение о том, что изменение активности углеводного метаболизма играет определенную роль в этом процессе: активность некоторых гликолитических ферментов, таких как гексокиназа, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа, фосфоглицераткиназа, фосфоглицератмутаза и лактатдегидрогеназа, увеличивается в стареющих фибробластах человека [30]; снижается активность некоторых ферментов цикла трикарбоновых кислот, таких как аконитаза и альфа-кетоглютаратдегидрогеназа, в то время как активность изоцитратдегидрогеназы увеличивается в стареющих митохондриях почек мыши [31]; снижается активность малат-аспартатного челнока в стареющих фибробластах человека [30]. Примечательно, что в контексте последнего наблюдения активация компонентов малат-аспартатной челночной системы увеличивает продолжительность жизни у дрожжей [32].

Цитозольная малатдегидрогеназа человека (МДГ1) является компонентом малат-аспартатной челночной системы, которая катализирует восстановление оксало-ацетата до малата с помощью переносчика НАД. После импорта в митохондрию малат окисляется до оксалоацетата с восстановлением НАД до НАДH митохондриальной малатдегидрогеназой (МДГ2). Суммарный эффект описываемой челночной системы заключается в транслокации восстановленных эквивалентов, образующихся при гликолизе, в митохондрии для генерации АТФ посредством окислительного фосфорилирования.

Возможность того, что цитозольная МДГ1 человека играет определенную роль в клеточном старении, подтверждается рядом сообщений. В молодых клетках человека МДГ, по-видимому, ассоциируется с р36 – регулятором активности МДГ, позволяющим цитозольному МДГ функционировать как челночный фермент; в стареющих клетках человека, напротив, МДГ, по-видимому, диссоциирован с р36, что отключает фермент, не позволяя ему направить поток водорода из цитозоли в митохондрии [33–36].

В исследовании S. Lee и соавт. [38] показано, что нокдаун МДГ1 индуцирует клеточное старение в фибробластах человека, тогда как нокдаун МДГ2 не влияет на старение. МДГ1 действует как ключевой регулятор клеточного старения через свою роль в окислении НАДH и последующей модуляции активности AМФ-активированной протеинкиназы и сиртуина-1.

Примечательно, что изменения в активности МДГ1 связаны с рядом заболеваний, в том числе боковым амиотрофическим склерозом, сахарным диабетом, шизофренией и дилатационной кардиомиопатией [39]. Считается, что ингибирование МДГ1 в раковых клетках может быть многообещающей терапией опухолевых заболеваний, поскольку активация клеточного старения является проверенной стратегией для необратимой остановки клеточного цикла [40].

В другом исследовании [41] диплоидные фибробласты человека, культивируемые in vitro, подверглись ограниченному количеству клеточных делений, известному как репликативное старение [42]. Репликативное старение использовано в качестве клеточной модели для изучения механизма старения. Для идентификации молекулярных изменений в стареющих фибробластах были выбраны высокопроизводительные подходы транскриптомики и протеомики. Протеомное профилирование дифференциально экспрессированных белков в молодых и старых фибробластах проводилось с использованием различных методов, таких как двумерный гель-электрофорез (2DGE), iTRAQ-маркировка, двумерный дифференциальный гель-электрофорез (2D-DIGE). Отмечено, что экспрессия белка МДГ2 была выше в стареющих клетках, чем в молодых. Хотя МДГ2 не может напрямую регулировать клеточное старение, он все же может влиять на энергетический метаболизм, так как является частью малат-аспартатного челнока. Повышение уровня белка МДГ2 позволяет предположить, что усиление активности данного фермента способствует выживанию стареющих клеток, увеличивая интенсивность углеводного обмена.

Недавно было обнаружено, что добавление пирувата индуцирует пролиферацию фибробластов посредством НАД+-зависимого синтеза аспартата в моделях остановки клеточного цикла, вызванных митохондриальной дисфункцией, и защищает фибробласты легких от старения путем увеличения соотношения НАД+/НАДH [43–45]. Однако физиологическая функция пирувата, лежащая в основе его протекторной роли в нормальных условиях, остается неизвестной.

В одном из исследований была показана роль пирувата в дермальных фибробластах человека в нормальных условиях [46]. Фибробласты культивировали в присутствии (Пир+) или отсутствии (Пир-) 1 мМ пирувата в течение 12 дней. Функциональным следствием лишения пирувата в культуральных средах было значительное снижение пролиферации фибробластов с 4-го дня. Кроме того, в Пир-клетках наблюдалось накопление клеток в фазе G2/M и повышение p53. Индуцированное депривацией пирувата старение фибробластов было определено на основе увеличения активности â-галактозидазы, снижения уровня внутриклеточного белка группы высокой подвижности В1.

Кроме того, морфология митохондрий Пир-фибробластов была изменена с линейной на круглую форму. Эти данные позволяют предположить, что отсутствие пирувата вызывает увеличение содержания аномальных митохондрий, которые производят меньше АТФ.

Сообщалось, что пируват необходим для митофагии – нормального процесса утилизации митохондрий – посредством стабилизации PINK1 [47]. При анализе содержания митохондрий в клетках Пир+ и Пир- с использованием зеленого красителя Mitotracker было установлено их увеличение примерно в четыре раза при отсутствии пирувата, что позволяет предположить в качестве причины – дефект митохондриального клиренса – митофагии.

Для определения влияния пирувата на старение кожи человека использовали модель кожного эквивалента, которая близко имитирует in vivo кожу человека, культивированную в присутствии или отсутствии пирувата в течение 7 дней после контакта с воздухом. Гистологический анализ показал, что эпидермис, включая роговой слой, у Пир- был тоньше, чем у Пир+. Несмотря на то что морфология и количество кожных клеток существенно не изменились, количество â-галактозидаз-положительных клеток, связанных со старением, увеличилось, а соотношение НАД+/НАДH в дерме Пир- уменьшилось по сравнению с дермой Пир+. Более того, уровень матричной металлопротеиназы-1, известной как фибробластная коллагеназа, и SASP были заметно повышены, а аномальные коллагеновые волокна были увеличены в дерме Пир-, как это описано для пожилой кожи [48], что указывает на то, что пируват также защищает от старения дермальные фибробласты.

В недавно опубликованном исследовании была показана выраженная антиоксидантная роль пирувата на культуре фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток [49]. Фибробласты человека (линия клеток Hs27) и эмбриональные стволовые клетки (линия клеток HUES3) подвергались воздействию возрастающих концентраций различных окислительных стресс-индуцирующих агентов: перекиси водорода, трет-бутил гидроксида и ротенона, в разные периоды времени: 1 час, 24 часа и 72 часа. Жизнеспособность клеток анализировалась методом измерения флуоресцентной активности реагента AlamarBlue. Все окислительные агенты, вызывающие стресс, имели кумулятивный эффект, зависящий от времени. Другие исследуемые антиоксиданты показали четкую кривую токсичности в обоих типах клеток, за исключением пирувата, который оказался не токсичен для соматических клеток. Защитное действие антиоксидантов впервые было оценено в фибробластах, подвергшихся воздействию повышенных концентраций перекиси водорода в течение 72 часов. Пируват показал важный дозозависимый защитный эффект, способный нейтрализовать токсичность Н2О2 до концентрации в 500 раз выше нормы. Все исследованные антиоксиданты показали частичную защиту только от некоторых прооксидантных агентов, в то время как пируват – от всех перечисленных.

Было исследовано антиоксидантное действие пирувата на физиологию митохондрий на клетках-фибробластах человека. Для этого использовали MitoTracker Зеленый для локализации всех митохондрий в клетке, MitoTracker Оранжевый – для того, чтобы локализовать митохондрии с высоким мембранным потенциалом, а Hoechst 33342 – для локализации ядер. При обработке фибробластов различными прооксидантными агентами в соответствии с распределением митохондрий с высоким мембранным потенциалом можно было наблюдать три различных паттерна окрашивания: равномерное цитоплазматическое распределение в здоровых клетках, периядерное распределение в поврежденных клетках и отсутствие флуоресценции в мертвых клетках. Эффект пирувата проявлялся в виде защиты от потери мембранного потенциала митохондрии, но не в случае окислительного стресса, вызванного ТГБ. Также пируват способен активировать синтез генов, ответственных за нормализацию свободно-радикальных процессов.

Что касается лактата, его влияние на пролиферативный потенциал фибробластов оказалось прямо противоположным [50]. Показано, что растущий в культуре фибробласт синтезирует и высвобождает лактат, способствуя усилению свободно-радикальных процессов через взаимодействие с хелатными комплексами железа. Взаимосвязь между лактатом и свободными радикалами заключается в реакции Фентона (реакция пероксида водорода с ионами железа), при которой лактат способствует комплексообразованию ионов железа в диапазоне физиологического pH в присутствии перекиси водорода. Увеличение содержания лактата и железа будет способствовать более выраженному протеканию названных процессов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, фибробласты представляют собой универсальную биологическую модель для изучения in vitro динамических молекулярных регуляторных процессов, лежащих в основе роста и пролиферации клеток, метаболизма и трансдукции внутри- и внеклеточных сигналов.

About the authors

Valeriya I. Kuzmicheva

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: bio-sam@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5232-1549

assistant of the Chair of fundamental and clinical biochemistry with laboratory diagnostics

Russian Federation, Samara

Larisa T. Volova

Samara State Medical University

Email: bio-sam@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8510-3118

PhD, Professor, the Head of Biotechnology Department of IEMB, director of Samara Tissue Bank

Russian Federation, Samara

Frida N. Gilmiyarova

Samara State Medical University

Email: bio-sam@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5992-3609

PhD, Professor, Chair of fundamental and clinical biochemistry with laboratory diagnostics

Russian Federation, Samara

Ilya M. Bykov

Kuban State Medical University

Email: bio-sam@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1787-0040

PhD, the Head of the Department of fundamental and clinical biochemistry

Russian Federation, Krasnodar

Elena V. Avdeeva

Samara State Medical University

Email: bio-sam@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3425-7157

Dr. Sci. of Pharmacy, Professor, Department of pharmacognosy with botany and the basics of phytotherapy

Russian Federation, Samara

Natalya A. Kolotieva

Samara State Medical University

Email: bio-sam@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7853-6222

PhD, Associate Professor, the Chair of fundamental and clinical biochemistry with laboratory diagnostics

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files