The role of single nucleotide variants of folate cycle genes of a mother with epilepsy in the occurrence of congenital malformations of the fetus

Full Text

Список сокращений

ВПР – врожденный порок развития;

ОНВ – однонуклеотидный вариант;

ПЭП – противоэпилептический препарат.

 ВВЕДЕНИЕ

Проблема возникновения врожденных пороков развития (ВПР) у детей женщин с эпилепсией изучается с начала 60-х годов ХХ века [1, 2]. Установлено, что уровень тератогенеза у женщин с эпилепсией, не получающих лечение противоэпилептическими препаратами (ПЭП), не превышает общепопуляционных значений в 3,5–5,0% [3], в то же время терапия ПЭП повышает риск пороков развития у плода в 2–3 раза [3, 4]. Факторами риска возникновения ВПР считается политерапия, прием определенных ПЭП, в первую очередь вальпроевой кислоты и топирамата, высокая суточная доза ПЭП [5–7].

Механизмы тератогенного влияния ПЭП до сих пор не известны. Предполагается эмбриотоксическое действие эпоксид-метаболитов ПЭП, которые опосредованно могут негативно влиять на синтез РНК и ДНК. В качестве тератогенного механизма рассматривается также фетальный оксидативный стресс [8]. Одним из наиболее важных факторов формирования ВПР в настоящее время принято считать нарушение фолатного цикла с дефицитом фолатов и гипергомоцистинемией [5, 9, 10]. Фолатный цикл – это цепь ферментативных взаимопревращений производных фолиевой кислоты (витамин B₉), который затрагивает базовые пути метаболизма клетки. Продукты фолатного цикла используются для таких клеточных процессов, как восстановление метионина, синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, метилирование ДНК [9].

В фолатном цикле участвует более десятка ферментов, основные из которых – MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктаза), MTR (метионин-синтаза), MTRR (метионин-синтаза-редуктаза, а также белок – переносчик фолатов в клетку SLC19A1. Для генов, кодирующих данные белки, описаны значимые однонуклеотидные варианты (ОНВ), которые приводят к изменению их активности [11]. Дефицит MTHFR приводит к снижению метилирования ДНК, что вызывает активацию генов, участвующих в росте и дифференцировке клеток. В случае снижения активности этого фермента у женщин фертильного возраста усиливается влияние тератогенных и мутагенных факторов внешней среды на плод, включая ксенобиотики, к которым относятся ПЭП [12]. Описаны ОНВ гена MTHFR c.677 С>Т (rs1801133) и с.1298 A>C (rs1801133), связанные с ферментативным дефицитом и развитием гипергомоцистеинемии [13]. Процесс реметилирования гомоцистеина в метионин осуществляется ферментом MTR, восстановление которого из неактивного состояния происходит под действием MTRR. Полиморфные варианты c.2756 (rs1805087) MTR и c.66 (rs1801394) MTRR приводят к снижению активности восстановления метионина из гомоцистеина, что усиливается при дефиците витамина В₁₂ [14]. На внутриклеточную концентрацию фолиевой кислоты влияет ОНВ c.80 (rs 1051266) SLC19A1, гомозиготный генотип GG которого является фактором риска пороков невральной трубки [15].

Из-за решающей роли в пути метаболизма фолатов однонуклеатидным вариантам C677T и A1298C в MTHFR, A2756G в MTR, A66G в MTRR и A80G в SLC19A1 уделяется наибольшее внимание в плане изучения риска развития пороков невральной трубки [11]. Между тем исследования ОНВ генов фолатного цикла в популяции женщин с эпилепсией, в том числе на фоне приема ПЭП, немногочисленны, а результаты неоднозначны. В связи с этим определение геномной архитектуры ВПР плода у женщин с эпилепсией является актуальной задачей.

ЦЕЛЬ

Изучить частоту носительства ОНВ rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR; rs1801394 гена MTRR, rs1805087 гена MTR и rs1051266 гена SLC19A1 у женщин с эпилепсией и оценить их ассоциации с ВПР плода.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследование была включена 61 пациентка с эпилепсией, имеющая в анамнезе одну и более беременность, не прервавшуюся в первом триместре, с известным исходом по наличию ВПР у ребенка. Пациентки были разделены на две группы: у 20 пациенток были зарегистрированы различные ВПР плода (основная группа), у 41 пациентки рожденные дети не имели ВПР (группа сравнения). Группы были сопоставимы по возрасту пациенток и формам эпилепсии. В период беременности не получали ПЭП 8/61 (13,1%) женщин, 37/61 (60,7%) женщин принимали один ПЭП, 16/61 (26,2%) получали политерапию. Лечение вальпроевой кислотой в монотерапии получали 23/37 (62,2%) пациентки, в политерапию вальпроевая кислота была включена у 13/16 (81,3%) пациенток. Таким образом, 36/61 (59,0%) пациенток получали вальпроевую кислоту в период беременности, 25/61 (41,0%) пациенток получали либо иные ПЭП, либо не принимали ПЭП в период беременности. ВПР плода были зарегистрированы у 14/36 (38,9%) пациенток, получавших лечение вальпроевой кислотой в период беременности, и у 6/26 (24,0%) женщин, не получавших вальпроевой кислоты.

Забор крови в объеме 10 мл из локтевой вены пациента производили в асептических условиях в вакуумные пробирки. Собранная кровь наносилась на бланки из фильтровального ватмана производства фирмы «Гринвен» (Россия). Выделение геномной ДНК осуществляли с использованием коммерческого набора «ДНК – экспресс кровь» производства НПФ «ЛИТЕХ». После проведения термического лизиса в твердотельном термостате «Термит» образец центрифугировался на ультраскоростной центрифуге Minispin (Эппендорф), и супернатант брался в работу. Путем проведения аллель-специфичной амплификации в амплификаторах «Терцик» (ДНК-технология) с последующим электорофорезом с бромистым этидием в 3% агарозном геле определялось носительство ОНВ rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR; rs1805087 гена MTR; rs1801394 гена MTRR и rs1051266 гена SLC19A1.

Для обозначения вариантов генотипа ОНВ rs1801133 (с.677 С>Т) гена MTHFR были приняты следующие обозначения: гомозиготный высокопродуцирующий – генотип СС (цитозин/цитозин), гетерозиготный генотип – СТ (цитозин/тимин), гомозиготный генотип по низкопродуцирующему аллелю – ТТ (тимин/тимин). Для обозначения вариантов генотипа ОНВ rs1801131 (с.1298 А>С) гена MTHFR были приняты следующие обозначения: гомозиготный высокопродуцирующий – генотип АА (аденин/аденин), гетерозиготный генотип – АС (аденин/цитозин), гомозиготный генотип по низкопродуцирующему аллелю – СС (цитозин/цитозин). Для обозначения вариантов генотипа ОНВ rs1805087 (с.2756 А>G) гена MTR были приняты следующие обозначения: гомозиготный высокопродуцирующий – генотип АА (аденин/аденин), гетерозиготный генотип – АG (аденин/гуанин), гомозиготный генотип по низкопродуцирующему аллелю – GG (гуанин/гуанин). Для обозначения вариантов генотипа ОНВ rs1801394 (с.66 А>G) гена MTRR были приняты следующие обозначения: гомозиготный высокопродуцирующий – генотип АА (аденин/аденин), гетерозиготный генотип – АG (аденин/гуанин), гомозиготный генотип по низкопродуцирующему аллелю – GG (гуанин/гуанин). Для обозначения вариантов генотипа ОНВ rs1051266 (с.80 А>G) гена SLC19A1 были приняты следующие обозначения: гомозиготный высокопродуцирующий – генотип GG (гуанин/гуанин), гетерозиготный генотип – GA (гуанин/аденин), гомозиготный генотип по низкопродуцирующему аллелю – АА (аденин/аденин).

По результатам исследования в программе MS Excel 2013 была сформирована база данных, на основе которой с помощью пакетов прикладных программ SPSS Statistics (версия 19.0) и онлайн-калькулятора для расчета равновесия Харди – Вайнберга (РХВ), доступного по электронному адресу https://wpcalc.com/en/equilibrium-hardy-weinberg/, осуществлялся статистический анализ. Для описания качественных данных использовали процент и 95% доверительный интервал (95% ДИ). Для определения статистической значимости отличий между качественными признаками применяли критерий хи-квадрат Пирсона (χ²) при значениях ожидаемых частот больше 5. Если более 20% ожидаемых частот были меньше 5, то использовался точный критерий Фишера. Для оценки факторов риска, ассоциирующихся с развитием ВПР, оценивали показатели отношения шансов (ОШ, 95% ДИ). Межгрупповые различия признавались как статистически значимые при значении р < 0,05. Для выявления паттерна сходства и формирования внутренне гомогенных блоков использована оригинальная авторская программа SANCT – structural analysis of contingency tables (N.N. Khromov-Borisov, T.B.L. Kist, G.B. Lazzarotto).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Распределение генотипов в основной группе и группе сравнения соответствовало закону Харди – Вайнберга, что свидетельствует о репрезентативности выборки и возможности экстраполировать результаты исследования на всю популяцию. Результаты частоты носительства аллелей и генотипов исследуемых ОНВ представлены в таблице 1. Частота носительства аллелей, а также гомозиготных генотипов по низкопродуцирующим, высокопродуцирующим и гетерозиготным генотипам ОНВ rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR; rs1805087 гена MTR; rs1801394 гена MTRR и rs1051266 гена SLC19A1 не отличалась у женщин, имеющих детей с ВПР, и женщин без ВПР у потомства.

 

Таблица 1. Частота носительства аллелей и генотипов ОНВ rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR; rs1805087 гена MTR; rs1801394 гена MTRR и rs1051266 гена SLC19A1

Table 1. The frequency of carriage of alleles and genotypes of the SNV rs1801133 and rs1801131 of the MTHFR gene; rs1805087 of the MTR gene; rs1801394 of the MTRR gene and rs1051266 of the SLC19A1 gene

Генотип/Аллели	ВПР есть (основная группа)		ВПР нет (группа сравнения)		Р	ОШ
	N	%	N	%		Абс.	95% ДИ
rs 1801133 гена MTHFR
Генотип
СС	12	60	24	59	0,89	1,1	0,32–3,7
СТ	8	40	17	42
ТТ	0	0	0	0
Всего	20	100	41	100
РХВ, р		0,34		0,11
Аллель
С	32	80	65	79	0,91	1,0	0,38–3,1
Т	8	20	17	21
Всего	40		82	100
rs 1801131 гена MTHFR
Генотип
АА	6	30	20	49	0,35	-	-
АС	11	55	16	39
СС	3	15	5	12
Всего	20	100	41	100
РХВ, р		0,84		0,34
Аллель
С	23	57	56	68	0,71	1,6	0,7–3,7
А	17	43	26	32
Всего	40		82
rs1801394 гена MTRR
Генотип
АА	3	15	6	15	0,44	-	-
AG	12	60	18	44
GG	5	25	17	41
Всего	20	100	41	100
РХВ, р		0,52		0,21
Аллель
A	18	57	30	68	0,93	1,4	0,6–3,3
G	22	43	52	32
Всего	40	100	82	100
rs1805087 гена MTR
Генотип
AA	12	60	27	66	0,66	-	-
AG	7	35	10	24
GG	1	5	4	10
Всего	20	100	41	100
РХВ, р		0,76		0,78
Аллель
A	31	77	64	78	0,91	1,0	0,6–2,8
G	9	23	18	22
Всего	40	100	82	100
rs1051266 гена SLC19A1
Генотип
AA	5	60	17	66	0,66	-	-
AG	9	35	11	24
GG	6	5	13	10
Всего	20	100	41	100
РХВ, р		0,52		0,002
Аллель
A	19	48	45	55	0,51	1,3	0,6–3,1
G	21	52	37	45
Всего	40	100	82	100

 

Принимая во внимание доказанную тератогенность вальпроевой кислоты, нами была предпринята попытка исследования ассоциаций ОНВ генов фолатного цикла у женщин, принимавших и не принимавших вальпроевую кислоту, с возникновением ВПР плода. Была оценена частота носительства ОНВ rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR; rs1801394 гена MTRR, rs1805087 гена MTR и rs1051266 гена SLC19A1 у женщин, получавщих вальпроевую кислоту в период беременности, по группам «ВПР плода есть» (n₁ = 14) и «ВПР плода нет» (n₂ = 22). Статистически значимых различий частоты носительства аллелей высокопродуцирующих, низкопродуцирующих гомозиготных и гетерозиготных генотипов исследованных ОНВ генов фолатного цикла у женщин, имеющих детей с ВПР и без ВПР, выявлено не было (таблица 2).

 

Таблица 2. Частота носительства аллелей и генотипов ОНВ генов MTHFR, MTR; MTRR; SLC19A1 у пациенток, получавших вальпроевую кислоту в период беременности

Table 2. The frequency of carriage of alleles and genotypes of the SNV genes MTHFR, MTR; MTRR; SLC19A1 in patients treated with valproic acid during pregnancy

Локус	ВПР есть n1 = 14	ВПР нет n2 = 22	χ2	Р	ОШ
					Абс.	ДИ
rs 1801133 гена MTHFR
Генотип
СС	8	11	-	-	1,2	0,5–2,7
СТ	6	11			0,8	0,4–1,9
ТТ	0	0			-	-
Аллели
С	22	33	0,06	0,81	1,2	0,3–6,1
Т	6	11			0,8	0,2-4,1
rs 1801131 гена MTHFR
Генотип
АА	5	11	0,76	0,68	0,7	0,3–1,7
АС	7	9			1,3	0,6–2,8
СС	2	2			1,3	0,5–3,9
Аллели
А	17	31	0,37	0,55	0,6	0,2–2,7
С	11	13			1,5	0,4–6,3
rs1801394 гена MTRR
Генотип
GG	3	8	1,64	0,44	0,6	0,2–1,8
АG	9	12			1,3	0,5–3,0
AA	2	2			1,3	0,5–3,9
Аллели
G	15	28	0,36	0,55	0,7	0,2–2,6
А	13	16			1,5	0,4–6,0
rs1805087 гена MTR
Генотип
AA	7	13	1,15	0,56	0,8	0,4–1,8
АG	7	8			1,4	0,6–3,2
GG	0	1			-	-
Аллели
А	21	34	0,03	0,88	0,9	0,2–4,2
G	7	10			1,1	0,2–5,4
rs1051266 гена SLC19A1
Генотип
AA	2	10	5,33	0,07	0,3	0,1–1,26
АG	7	4			2,3	1,1–4,9
GG	5	8			0,9	0,4–2,3
Аллели
А	11	24	0,79	0,37	0,5	0,1–2,1
G	17	20			1,9	0,5–7,2

 

В результате обработки было выделено два внутренне гомогенных блока гаплогрупп ОНВ rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR; rs1801394 гена MTRR, rs1805087 гена MTR и rs1051266 гена SLC19A1, имеющих статистические значимые различия (таблица 3).

 

Таблица 3. Блоки гаплогрупп ОНВ rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR; rs1801394 гена MTRR, rs1805087 гена MTR и rs1051266 гена SLC19A1, объединенные программой SANCT

Table 3. The blocks of the SNV haplogroups rs1801133 and rs1801131 of the MTHFR gene; rs1801394 of the MTRR gene, rs1805087 of the MTR gene and rs1051266 of the SLC19A1 gene combined by the SANCT program

Гаплогруппы	ВПР плода
	Есть (n = 40)	Нет (n = 82)	p
Блок 1
TAAAA	3	7	0,24
TAAAG	4	3
TAGAG	1	2
CAAAG	5	4
CAAGG	1	0
CAGAA	0	14
CAGGA	2	5
CAGAG	3	7
CAGGG	3	5
CCAAG	2	10
CCAGA	3	1
CCGAA	8	5
CCGAG	4	5
Блок 2
CCGGA	0	2	1,00
CCGGG	0	3
TAAGA	0	1
TAGAA	0	4
CAAAA	0	3
CAAGA	0	1
CAGAA	1	0
Всего	40	82
P	0,01

 

Выявлена статистически значимая взаимосвязь между носительством определенной гаплогруппы матери и формированием врожденных пороков развития плода (таблица 4). Показано, что женщины, имеющие детей с ВПР, статистически значимо чаще являлись носителями гаплогрупп из блока 1 (TAAAA, CAGAG, CAGGA, TAGAG, CAGGG, CCGAG, TAAAG, CAAAG, CCGAA, CCAGA, CAAGG, CAGAA, CCAAG) – в 39/40 (97,5%) случаях против 68/82 (82,9%) у обследованных без ВПР (ОШ 8,029 [95% ДИ 1,017–63,418], p = 0,022). Носительство гаплогрупп, объединенных во второй блок (TAAGA, TAGAA, CAAAA, CAAGA, CAGAA, CCGGA, CCGGG), встречалось у матерей детей с ВПР только в 1/40 (2,5%) случае, тогда как у матерей детей без ВПР – в 14/82 (17,1%), что может быть расценено как статистически значимый протективный фактор (ОШ 0,026 [95% ДИ 0,016–0.984] p = 0,022).

 

Таблица 4. Частота встречаемости гаплогрупп ОНВ rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR; rs1801394 гена MTRR, rs1805087 гена MTR и rs1051266 гена SLC19A1 у матерей детей с ВПР и без ВПР

Table 4. The frequency of occurrence of SNV haplogroups rs1801133 and rs1801131 of the MTHFR gene; rs1801394 of the MTRR gene, rs1805087 of the MTR gene and rs1051266 of the SLC19A1 gene in mothers of children with and without congenital malformation

Гаплогруппы	ВПР плода		Всего
	Есть (n = 40)	Нет (n = 82)
Блок 1 TAAAA, CAGAG, CAGGA, TAGAG, CAGGG, CCGAG, TAAAG, CAAAG, CCGAA, CCAAG, CCAGA, CAAGG, CAGAA	39 97,5%	68 82,9%	107 87,7%
Блок 2 TAAGA, TAGAA, CAAAA, CAAGA, CAGAA, CCGGA, CCGGG	1 2,5%	14 17,1%	15 12,3%
Всего	40 (100,0%)	82 (100,0%)	122 (100,0%)
P	0,022

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Хорошо известно, что ВПР являются следствием возникновения комбинаций определенных вариантов генов и их взаимодействия с факторами окружающей среды [16]. Проведенное исследование не показало статистически значимой разницы в частоте носительства ОНВ rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR; rs1801394 гена MTRR, rs1805087 гена MTR и rs1051266 гена SLC19A1 между матерями детей с ВПР и без ВПР, что не позволяет использовать результаты генотипирования ОНВ отдельных генов фолатного цикла для прогнозирования развития ВПР плода. Идентичные данные были получены в исследовании W.K. Dewelle и соавт. (2023), которые оценивали такой же комплекс ОНВ генов фолатного цикла у более обширной выборки [17]. Значимых ассоциаций с различными ВПР плода также не было выявлено и в других исследованиях [18, 19].

Имеются данные о сочетанном влиянии носительства матерью ОНВ генов фолатного цикла и приема ПЭП в период беременности на возникновение ВПР плода [8]. Учитывая, что высокий тератогенный потенциал описан у вальпроевой кислоты, матери, получающие этот ПЭП в период беременности, были выделены в отдельную группу. Не было выявлено статистически значимых отличий в частоте носительства аллелей, гомозиготных генотипов по высокопродуцирующим аллелям, низкопродуцирующим аллелям, а также гетерозиготным носителям ОНВ rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR; rs1801394 гена MTRR, rs1805087 гена MTR, rs1051266 гена SLC19A1 между матерями детей с ВПР и без ВПР как среди получавших вальпроевую кислоту в период беременности, так и среди не леченных этим ПЭП. Таким образом, не было выявлено ассоциаций между исследованными ОНВ генов фолатного цикла матери и возникновением ВПР плода, в том числе на фоне приема ПЭП.

В настоящий момент большинство авторов признает, что нет единственных генов-кандидатов для прогноза ВПР плода и ведения беременности высокого риска и необходима оценка полигенного риска, когда суммируется генетический риск нескольких ОНВ, связанных с определенным фенотипом [20–22]. Использование оригинальной программы SANCT позволило выделить два блока однородных гаплогрупп, имеющих статистически значимые различия между собой. Далее было показано, что сочетанное носительство определенных вариантов аллелей по всем исследованным генам фолатного цикла матерью может расцениваться как фактор риска ВПР плода (ОШ 8,029 [95% ДИ 1,017–63,418], p = 0,022) или протективный фактор (ОШ 0,026 [95% ДИ 0,016–0,984] p = 0,022). Следует признать, что настоящее исследование включает небольшое количество женщин с эпилепсией, поэтому полученные результаты необходимо трактовать с осторожностью, особенно при использовании в клинической практике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты исследования носительства отдельных ОНВ rs1801133 и rs1801131 гена MTHFR; rs1801394 гена MTRR, rs1805087 гена MTR и rs1051266 гена SLC19A1 в настоящее время не могут быть использованы в качестве достоверного прогностического инструмента ВПР плода у женщин с эпилепсией. Возникновение ВПР у ребенка является мультифакториальным явлением, в котором генетические факторы с небольшим размером эффекта могут играть значимую роль только в случае определенных неблагоприятных комбинаций.

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ	ADDITIONAL INFORMATION
Источник финансирования. Работа выполнена по инициативе авторов без привлечения финансирования.	Study funding. The study was the authors' initiative without external funding.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.	Conflict of Interest. The authors declare that there are no obvious or potential conflicts of interest associated with the content of this article.
Участие авторов. А.В. Якунина, В.А. Калинин – сбор и обработка материала, написание текста, составление списка литературы. Ю.В. Мякишева – концепция и дизайн исследования, редактирование текста. А.А. Усольцева – статистическая обработка данных. И.Е. Повереннова – редактирование текста. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.	Contribution of individual authors. A.V. Yakunina, V.A. Kalinin – scientific data collection, systematization and analysis, writing of the first draft of the manuscript. Yu.V. Myakisheva – development of the study concept, detailed manuscript editing and revision. A.A. Usoltseva – statistical data processing. I.E. Poverennova – detailed manuscript editing and revision. All authors gave their final approval of the manuscript for submission, and agreed to be accountable for all aspects of the work, implying proper study and resolution of issues related to the accuracy or integrity of any part of the work.

About the authors

Albina V. Yakunina

Samara State Medical University

Author for correspondence.
Email: a.v.yakunina@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-7996-5213

PhD, Associate professor of the Department of neurology and neurosurgery

Russian Federation, Samara

Anna A. Usoltseva

Professor V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: a.usoltseva@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-9678-6719

assistant of the Department of medical genetics and clinical neurophysiology of the Institute of Postgraduate Education

Russian Federation, Krasnoyarsk

Vladimir A. Kalinin

Samara State Medical University

Email: v.a.kalinin@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-3233-8324

PhD, MD, Professor of the Department of neurology and neurosurgery

Russian Federation, Samara

Irina E. Poverennova

Samara State Medical University

Email: i.e.poverennova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2594-461X

PhD, MD, Professor, Head of the Department of neurology and neurosurgery

Russian Federation, Samara

Yulia V. Myakisheva

Samara State Medical University

Email: yu.v.myakisheva@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-0947-511X

PhD, MD, Head of the Department of general and molecular biology

Russian Federation, Samara

References

Supplementary files