In vitro клеточная гиперурикемическая гемотест-система для определения цитокинового статуса пациентов с подагрическим артритом

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Подагра – системное заболевание, характеризующееся отложением кристаллов моноурата натрия (МУН) и образованием тофусов [1]. Острый подагрический артрит обычно начинается с внезапной острой боли. Характерно поражение плюснефалангового сустава большого пальца стопы (что и носит название «подагра»). Тофусы внутри и вне суставов могут ограничивать объем движений и вызывать деформации, приводя к развитию хронического подагрического артрита. Данная патология часто развивается у лиц с гиперурикемией (ГУ), то есть с повышенным уровнем мочевой кислоты (МК) в сыворотке крови. Хотя ГУ при отсутствии подагры часто описывается как «бессимптомная», новейшие исследования указывают на тесную связь ГУ и риском развития артериальной гипертензии, почечной недостаточности [2] и сердечно-сосудистых заболеваний [3–5]. МК является конечным продуктом метаболизма пуринов в организме человека и синтезируется преимущественно в печени, кишечнике и эндотелии сосудов [6]. Уровень МК в сыворотке, превышающий 420 мкМ, официально считается ГУ. При этом часто у женщин до менопаузы МК ≤360 мкМ, и после менопаузы МК повышается до концентраций, наблюдаемых у мужчин. Для детей и подростков МК считается нормой при концентрации ≤330 мкМ [7]. В водных растворах при концентрации 420 мкМ соли МК из растворимой формы переходят в кристаллическую, однако порог растворимости уратов в плазме значительно повышен и их концентрации могут достигать >600 мкМ без образования кристаллов. Острый приступ подагры всегда ассоциирован с выпадением кристаллов МК в полость сустава. Эпидемиологические данные указывают на тесную связь между ГУ и риском развития подагры [8]. Однако накопленные клинические данные свидетельствуют о том, что эта зависимость не линейна [9, 10]. Более того, отложение кристаллов МК обнаруживается в суставном хряще у пациентов без эпизодов подагрического артрита [11]. Объяснение может лежать в плоскости индивидуальной чувствительности инфламмасомы, ответственной за синтез воспалительных интерлейкинов, которая активируется под воздействием ГУ. Поэтому низкая чувствительность инфламмасомы вполне может объяснять бессимптомное накопление солей МК в суставных тканях. С другой стороны, атаки подагрического артрита всегда обусловлены синтезом воспалительных цитокинов. Высокие уровни цитокинов 1â (IL-1â), IL-6 и TNF-á найдены в синовиальной жидкости больных с подагрическим артритом в период обострения [12]. Повышенные уровни цитокинов IL-6 и TNF-á были обнаружены также в плазме больных с подагрой в период обострения, но не у больных с подагрой в фазе ремиссии [13]. Исследования по сравнению уровней цитокинов IL-1â, IL-6, IL-8, IL-17А, IL-18, IL-22 и IL-23 в сыворотке крови и клиническими проявлениями подагры обнаружили прямую корреляцию только в отношении IL-18, и очень незначительное увеличение IL-6 было зарегистрировано в сыворотке больных, имеющих тофусную форму подагры [14]. Повышенные значения IL-18 и IL-17A были найдены в сыворотках больных с подагрическим артритом [15]. Интересно, что у больных подагрой в сыворотке высокий уровень IL-1â не обнаруживается [13, 14]. Тем не менее существует достаточное количество клинических доказательств ключевой роли IL-1â в развитии подагры. Клинические исследования ингибиторов IL-1â продемонстрировали эффективность в борьбе с воспалительным процессом при подагре [16].

В настоящее время подагрический артрит рассматривается как системное воспалительное заболевание, вызванное активацией инфламмасомы NLRP3 (NOD-подобного рецепторного белка 3) [17, 18]. Инфламмасомы представляют собой многомолекулярные комплексы, которые создаются в цитоплазме клеток в ответ на клеточное повреждение и инфекции [19]. Общепринятая двухсигнальная система активации инфламмасомы NLRP3 продемонстрирована на рисунке 1.

 

Рисунок 1. Двухсигнальная активация NLRP3 инфламмасомы. Активированные инфламмасомы NLRP3 способствуют высвобождению Caspase-1, которые переводят неактивные формы про-IL-1b и про-IL-18 в зрелые активные IL-1b и IL-18 соответственно. Gasdermin-D-опосредованный каскад воспалительных реакций обеспечивает образование мембранных пор, через которые идет выброс зрелых IL-1b и IL-18 в окружающую среду.

Figure 1. Two-signal pathway activation of the NLRP3 inflammasome. Activated NLRP3 inflammasomes promote the release of Caspase-1, which converts the inactive forms of pro-IL-1b and pro-IL-18 to mature active IL-1b and IL-18, respectively. Gasdermin-D-mediated inflammatory signaling cascade provides the formation of membrane pores through which mature IL-1b and IL-18 are released into the environment.

 

Только комбинация двух сигналов опосредует и индуцирует серию каскадных реакций подагрического воспаления при участии гемопоэтических клеток – макрофагов, моноцитов и нейтрофилов [14, 17, 20, 21]. Природа данных сигналов до конца не установлена. Считается, что сигнал 1 сенсибилизирует клетки через PRR-паттерн-распознающие рецепторы (priming) и только после сенсибилизации клеток сигнал 2 (в частности МК) вызывает активацию инфламмасомы NLRP3. Изначально считалось, что МК вызывает воспаление через активацию инфламмасом NLPR3 только вследствие формирования кристаллов [22]. Позднее было продемонстрировано, что растворимая форма МК, проникая в клетки через специальные транспортеры, также может активировать инфламмасому NLPR3, вызывая высвобождение медиаторов воспаления [18]. Сигнал 1 обеспечивает транскрипцию компонентов инфламмасомы, про-caspase 1 и про-IL-1â через активацию транскрипционного фактора NF-kB. Надо отметить, что в отличие от IL-1â транскрипция IL-18 имеет конститутивный характер и, значит, мРНК IL-18 всегда находится в наличии для синтеза белковых форм IL-18 [23, 24]. Только при наличии двух сигналов идет образование Gasdermin-D – регулируемых мембранных пор и высвобождение зрелых форм интерлейкинов IL-1â и IL-18 в окружающую среду, что имеет решающее значение для инициирования острой воспалительной реакции при обострении подагры.

Активаторами инфламмасомы NLRP3 могут быть вирусы, бактерии, грибки, токсины, АТФ, частицы кристаллов квасцов, кремниевой кислоты, асбеста, холестерина, МК в растворимой и кристаллической форме, химические раздражители, УФ-свет В-диапазона, амилоид-â и амилин островков поджелудочной железы [25–27]. С учетом разнообразной природы активаторов NLRP3 было высказано предположение, что не все активаторы непосредственно связываются с инфламмасомой [28]. Большинство из них, вероятно, действует посредством выделения или модификации общего медиатора, который и является истинным лигандом NLRP3, природа которого остается пока неизвестной. В существующей на настоящий день модели активации инфламмасомы NLRP3 МК отводится роль сигнала 2, а природа сигнала 1, который сенсибилизирует (priming) клетки, еще до конца не выяснена.

Мы предположили, что клетки крови от пациентов с ГУ уже сенсибилизированы в условиях in vivo сигналом 1 и могут быть использованы в качестве персонифицированной клеточной тест-системы in vitro с добавлением контролируемой концентрации сигнала 2 (МК) для выявления индивидуальной картины продукции воспалительных цитокинов. Традиционно анализ стимуляции цитокинов in vitro выполняется на изолированных мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC). В предыдущей работе нами была продемонстрирована донор-специфическая продукция цитокинов мононуклеарными клетками крови in vitro под влиянием иммуномодуляторов [29]. Однако выделение PBMC является трудоемким процессом, что ограничивает возможность обработки большого количества образцов, необходимых для масштабированной диагностики. Кроме этого, в процессе выделения PBMC идет потеря как сигнальных молекул воспаления, так и клеточных популяций. При подагре, которая характеризуется системными признаками воспаления, клеточные источники медиаторов воспаления еще не охарактеризованы должным образом. В последние годы в диагностике наблюдается тенденция к использованию цельной крови для ex vivo стимуляции продукции цитокинов, что более точно имитирует физиологические условия in vivo по сравнению с методами, которые требуют изоляции PBMC [30]. Физиологические концентрации некоторых цитокинов в цельной крови могут быть достаточно высокими, поэтому, чтобы снизить их эффект воздействия на стимуляцию клеток in vitro, мы посчитали целесообразным использовать разбавленную кровь доноров питательной средой RPMI, предназначенной для культивирования клеток in vitro. Использование разбавленной крови доноров позволяет максимально сохранить популяционный набор гемопоэтических клеток, которые уже сенсибилизированы сигналом 1 in vivo, и при этом снизить уровень содержания сигнальных молекул 2.

В данной работе мы провели скрининг провоспалительных цитокинов в сыворотке доноров и отработали условия индукции данных цитокинов in vitro при высоком содержании МК, используя клетки разбавленной крови индивидуальных доноров.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Провести скрининг провоспалительных цитокинов в сыворотке индивидуальных доноров, отработать in vitro условия стимуляции активности инфламмасомы NLRP3 с использованием МК и выяснить, продукция каких провоспалительных цитокинов может быть индуцирована в условиях in vitro высоким содержанием МК.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования послужили образцы крови потенциально здоровых лиц из Самарской областной клинической станции переливания крови (СОКСПК) и образцы крови пациентов с гиперурикемией и диагнозом «подагрический артрит» из Клиник Самарского государственного медицинского университета (Клиники СамГМУ). В рамках проведения исследования была оформлена разрешительная документация биоэтического комитета СамГМУ (протокол №215 от 20.01.2021 г.). В 100% эпизодов с пациентами СОКСПК это были лица мужского пола. Пациенты из Клиник СамГМУ были обоего пола. Характеристики пациентов с подагрическим артритом представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Характеристика пациентов с подагрическим артритом из Клиник СамГМУ

Table 1. Profile of patients with gouty arthritis from the Clinics of the Samara State Medical University

№ пациента	П МК 372,12	П МК 375,8	П МК 450	П МК 519	П МК 620
Пол	жен.	жен.	жен.	муж.	муж.
Возраст	68	66	63	47	43
Диагноз	подагрический артрит, обострение
МК сыворотки, мкмоль/л	372,12	375,8	450	519	620
Количество деформированных суставов	0	0	3	2	2

 

Отбор участников исследования из реестра доноров СОКСПК производили рандомизированно. Каждый участник подписал добровольное информированное согласие на обработку персональных данных, а также на передачу биологического материала (венозной крови) в рамках проводимого исследования. Венозную кровь забирали в вакуумные пробирки с ЭДТА (Kometaline, Россия). Процедуру проводили утром натощак. Вакутейнеры с кровью хранили при комнатной температуре не более 4 часов после забора крови. Для определения цитокинового статуса доноров изучали продукцию цитокинов IL-1â, IL-6, IL-18 и TNF-á в сыворотке доноров.

Приготовление растворимой МК (99+%, Thermo Fisher Scientific, США) проводили как описано в статье [18]. Исходный раствор МК (сток) был приготовлен следующим образом: 60 мг МК растворили в 70 мл дистиллированной воды, прогретой до 30°С. Затем с помощью 0,5 М NaOH раствор довели до рН 7,3. Конечная концентрация МК в 100 мл составляла 3,5 мМ. Раствор профильтровали через 0,22 микронный фильтр и аликвоты хранили в стерильных флаконах. В день эксперимента сток раствор МК прогревали до 37°С и разводили прогретой питательной средой RPMI («БиолоТ», Россия), содержащей 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина («БиолоТ», Россия). В поляризованном свете микроскопа кристаллы не были обнаружены ни в исходном 3,5 мМ растворе, ни в питательной среде, содержащей 1 мМ МК (данные не представлены).

Дизайн исследования. Цельную кровь доноров разводили питательной средой RPMI, содержащей 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина («БиолоТ», Россия). 200 мкл аликвоты десятикратно разбавленной крови с добавленной МК в концентрации 0,5 и 1 мМ разливали по лункам 96-луночного планшета (TPP, Швейцария) в множественных репликах. Планшеты инкубировали при 37°С и 5% СО₂ в течение 16±4 часов. При оценке цитокинового статуса пациентов с острой формой подагры использовали пятикратно разбавленную кровь с добавленной МК в концентрации 1 мМ и полученные образцы разливали по 200 мкл на лунку в 96-луночный планшет (Biofil, Китай). Планшеты инкубировали при 37°С и 5% СО₂ в течение 22±4 часов. Через указанное время проводили отбор 100 мкл культуральной среды в 1,5 мл микропробирки, которые замораживали при -20°С для иммуноферментного анализа (ИФА).

Иммуноферментный анализ (ИФА). Образцы сывороток и культуральной среды клеток анализировали в соответствии с инструкциями производителя ИФА «Вектор-Бест» (ООО «Вектор», Россия). Чувствительность ИФА составляла 1; 0,5; 2 и 1 пг/мл для IL-1â, IL-6, IL-18 и TNF-á соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Обычно для оценки цитокинового статуса больного исследуют уровень цитокинов в сыворотке или плазме. Для начала мы провели скрининг провоспалительных цитокинов в сыворотках доноров. Выбор был сделан в пользу нескольких провоспалительных молекул IL-1â, IL-6, IL-18 и TNF-á, которые описаны в литературе как принимающие участие в патогенезе подагры. Согласно опубликованным данным, средний уровень IL-1â, IL-6, IL-18 и TNF-á в сыворотках составлял 3,6±1,01; 4,7±0,84; 267,1±14,63; и 1,2±0,13 соответственно [31]. Анализ цитокинов в сыворотках здоровых доноров (СОКСПК) с помощью ИФА («Вектор-бест») продемонстрировал предельно низкие значения IL-1â и TNF-á на уровне порога детекции ИФА, а также показал донор-специфичное содержание цитокинов IL-6 и IL-18 (рисунок 2А). Примечательно, что уровни инфламмасом-регулируемых цитокинов IL-1â и IL-18 в сыворотке крови доноров кардинально отличались: IL-1â присутствовал в минимальных количествах (<10 пикограммы/мл), а концентрация IL-18 достигала 200 пг/мл.

 

Рисунок 2. (А) ИФА интерлейкинов в сыворотке доноров. (Б) Содержание TNF-á в культуральной среде клеток крови доноров с нормоурикемией (Д МК 232,4 и Д МК 387,9, с показателями мочевой кислоты в крови 232,4 и 387,9 мкмол/л соответственно) и гиперурикемией (ГУ МК 454,1, с показателем мочевой кислоты в крови 454,1 мкмол/л) при отсутствии (0) и присутствии мочевой кислоты (МК) в концентрации 0,5 и 1 мМ.

Figure 2. (A) Analysis of interleukins in donor serum by ELISA. (Б) The amount of TNF-á in the conditioned medium of blood cells, obtained from donors with normouricemia (Д МК 232.4 and Д МК 387.9, with an indicator of uric acid in the blood of 232.4 and 387.9 μmol/l, respectively) and hyperuricemia (ГУ МК 454.1, with an indicator of uric acid in the blood 454.1 μmol/l) in the absence (0) and the presence of uric acid (UA) at 0.5- and 1-mM concentration.

 

По-видимому, это связано с конститутивной экспрессией IL-18 гена и альтернативными путями регуляции синтеза зрелых форм цитокина IL-18 [24, 32]. Нашей задачей было отработать in vitro стимуляцию клеток крови МК, имитируя условия ГУ. Учитывая, что формирование кристаллов in vivo возможно при сывороточном уровне МК >420–600 мкмоль/л, нами были выбраны две концентрации МК: 0,5 мМ, что соответствует ГУ, и 1 мМ, что соответствует предельно высокой концентрации МК, при которой возможно образование кристаллов. Однако анализ среды RPMI, содержащей 1 мМ МК, в поляризационном свете микроскопа не обнаруживал кристаллы (данные не показаны). Чтобы быть уверенным, что концентрации МК соответствуют добавленным, был выбран донор с пограничным показателем МК в сыворотке 392,1 мкмоль/л и определены концентрации МК в культуральной среде десятикратно разбавленной крови данного донора с добавленной МК в конечной концентрации 0,5 и 1 мМ (таблица 2). Результаты анализа МК в культуральной среде 1 десятикратно разбавленных клеток крови донора сопоставимы с добавленным количествам МК.

 

Таблица 2. Концентрация мочевой кислоты (МК) в сыворотке и культуральной среде клеток донора. Кровь донора с показателем МК в сыворотке 392,1 мкмол/л была десятикратно разбавлена средой RPMI, содержащей 0,535 и 1075 мкмоль/л МК, и затем концентрация МК в культуральной среде была определена с помощью анализатора крови BM/Hitachi 902

Table 2. The concentration of uric acid (UA) in the serum and cell growth medium of donor cells. Donor blood with a serum UA of 392.1 µmol/L was diluted 10-fold with RPMI medium containing 0.535 and 1075 µmol/L UA and then the concentration of UA in the cell growth medium was determined using a BM/Hitachi 902 blood analyzer

	Сыворотка донора	Десятикратно разбавленная кровь донора
Добавленная МК (мкмоль/л)	0	0	535	1075
Результаты анализа МК (мкмоль/л)	392,1	43,1	607,3	916,8

 

Используя отработанные условия in vitro с добавлением 0,5 и 1 мМ МК в культуральную среду клеток, были проведены пилотные эксперименты по оценке продукции воспалительных цитокинов клетками крови доноров, у которых показания МК в сыворотке варьировали от нормальных (232,4 мкмоль/л) до соответствующих ГУ (454,1 мкмоль/л). Значения МК в сыворотке доноров указаны в идентификационном номере доноров – 232,4, 387,9 и 454,1 мкмоль/л соответственно. Результаты ИФА продемонстрировали фоновые показатели присутствия TNF-á в культуральной среде клеток крови доноров, инкубированных в присутствии повышенных концентраций МК (0,5 и 1 мМ). Чувствительность иммуноферментного анализа ИФА («Вектор-Бест») для TNF-á составляла 1 пг/мл. И хотя TNF-á концентрация в культуральной среде росла с увеличением концентрации МК, значения TNF-á варьировали в пределах 5–10 пг/мл, что недостаточно для диагностически значимой достоверности результатов, учитывая донор-специфические вариации (рисунок 2Б). При анализе продукции инфламмасом-регулируемого цитокина IL-1â мы столкнулись с проблемой существенной количественной вариабельности результатов, что требует более доскональных исследований (данные не приведены).

Клетки крови тех же доноров продуцировали значительные количества (сотни пикограмм на мл) провоспалительных цитокинов IL-6, IL-18 в ответ на повышенные концентрации мочевой кислоты в культуральной среде (рисунок 3).

 

Рисунок 3. ИФА IL-6 и IL-18 в культуральной среде, содержащей клетки крови доноров (Д с показателями МК в крови 232,4 и 387,9 мкмол/л соответственно) и пациента с гиперурикемией (ГУ с показателем МК в крови 454,1) в отсутствии (0) и присутствии МК (0,5 и 1 мМ).

Figure 3. ELISA analysis for IL-6 and IL-18 in a cell growth medium containing blood cells from donors (Д with UA in blood 232.4 and 387.9 µmol/L, respectively) and a patient with hyperuricemia (ГУ with UA in blood 454.1) in the absence of (0) and the presence of UA (0.5 and 1 mM).

 

При этом МК в концентрации 0,5 мМ не вызывала существенных изменений в продукции интерлейкинов IL-6, IL-18 (рисунок 3) и только в присутствии 1 мМ МК наблюдался выраженный стимулирующий эффект на продукцию данных цитокинов клетками крови доноров. Наиболее существенное 30–40-кратное увеличение продукции наблюдалось для инфламмасом-регулируемого цитокина IL-18, что делает его потенциальном маркером для анализа пациентов с ГУ. Интересно, что при оценке воспалительных цитокинов IL-6 в тех же образцах культуральных сред наблюдался обратный эффект продукции данного цитокина по сравнению с IL-18. В образцах клеток крови пациента с высоким содержанием МК (454,1) наблюдалась минимальная продукция IL-6. IL-6 описан как цитокин, значения которого повышены в плазме больных подагрой в период обострения, но не у пациентов с подагрой в период ремиссии [13]. Нас заинтересовал эффект обратной корреляции продукции IL-18 и IL-6 при in vitro стимуляции МК крови доноров. Были выбраны пациенты с подагрическим артритом в период обострения и проведен in vitro анализ продукции IL-18 и IL-6 клетками крови данных пациентов в сравнении с потенциально здоровыми донорами (рисунок 4). При клиническом обострении подагры продукция IL-6 в культуральную среду клетками пациентов (П МК) была снижена, в то время как клетки потенциально здоровых доноров продолжали вырабатывать IL-6 (рисунок 4А). Анализ этих же культуральных сред показал активность клеток пациентов с подагрическим артритом в период обострения вырабатывать повышенные количества IL-18 в присутствии МК (рисунок 4Б), что соответствует литературным данным о повышенном содержании IL-18 в сыворотках больных с острой формой подагры.

 

Рисунок 4. ИФА IL-6 и IL-18 в культуральной среде, содержащей клетки крови доноров (Д) и пациентов с подагрическим артритом в период обострения в отсутствии (0) и присутствии мочевой кислоты (1 мМ МК).

Figure 4. ELISA analysis of IL-6 and IL-18 in a cell growth medium containing blood cells of donors (Д) and patients with acute gouty arthritis in the absence (0) and the presence of uric acid (1 mM UA).

 

Несмотря на пилотные исследования с маленькой выборкой пациентов, можно сказать, что эти результаты подтверждают наше предположение, что in vivo сенсибилизированные сигналом 1 клетки крови больных подагрой реагируют на стимуляцию МК иначе, чем клетки крови здоровых доноров.

Разработанная гиперурикемическая гемотест-система in vitro для анализа ГУ стимулированной активности инфламмасом пациентов является более адекватной моделью, чем цельная кровь или сыворотка, поскольку используются уже in vivo сенсибилизированные сигналом 1 клетки крови пациентов, природа которого до конца не выяснена, и в культуральную среду можно подобрать четко заданные концентрации МК (сигнал 2) и таким образом оптимизировать экспериментальные условия in vitro. Сывороточные значения большинства цитокинов находятся на границе уровня детекции, и их накопление в сыворотке зависит от многих факторов. Гиперурикемическая гемотест-система позволяет увеличить уровень детекции цитокинов по сравнению с сывороткой и при этом четко контролировать концентрацию сигнальных молекул, характерных для того или иного заболевания.

Недостатком данного подхода является чувствительность клеток к изменениям температуры, состава питательной среды, производителю планшетов и ИФА, что влияет на количественные значения цитокинов. В частности, с такой проблемой мы столкнулись при анализе продукции инфламмасомного цитокина IL-1 (данные не приведены). Разрешить проблему количественных вариаций поможет нахождение закономерной корреляции в продукции нескольких цитокинов при равных условиях. Тогда после масштабированного исследования пациентов можно ввести индексы корреляции, характерные для той или иной патологии.

Выраженный эффект обратной корреляции между продукцией инфламмасомного интерлейкина IL-18 и цитокина широкого спектра действия IL-6 клетками крови пациентов с ГУ (включая больных с подагрическим артритом в период обострения) в условиях in vitro представляет собой особый научный интерес и требует дальнейших более масштабированных исследований в рамках создания гиперурикемической гемотест-системы для персонифицированной диагностики.

ВЫВОДЫ

В рамках создания персонифицированной клеточной тест-системы разработаны in vitro условия стимуляции МК клеток крови от индивидуальных доноров. Показано, что разработанная гиперурикемическая гемотест-система, основанная на использовании разведенной питательной средой крови индивидуальных доноров, может служить адекватной клеточной моделью in vitro для изучения влияния сигнальных молекул воспаления. Результаты анализа гиперурикемической гемотест-системы in vitro с использованием разбавленной крови потенциально здоровых доноров и пациентов, клетки которых были сенсибилизированы в условиях in vivo к присутствию специ-фичных факторов, характерных для подагры, показали различия в продукции цитокинов IL-18 и IL-6. Это может быть использовано в персонифицированной диагностике для прогнозирования развития не только подагры, но и других патологий.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Исследование финансировалось при поддержке госзадания (номер государственного учета в системе ЕГИСУ НИОКТР 122020100107-2).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Л.Т. Волова – инициирование и организация исследования; редактирование рукописи. Е.И. Пугачев – проведение экспериментальных исследований; анализ результатов исследования. Т.В. Старикова – проведение экспериментальных исследований. П.А. Лебедев – организация теоретической и клинической части исследований; интерпретация результатов исследования. И.А. Шафиева – координация сбора лабораторного материала. С.И. Кузнецов – координация сбора лабораторного материала. О.А. Гусякова – организация и проведение лабораторных исследований. Г.Н. Светлова – координация исследования. Н.К. Осина – оформление дизайна исследования; интерпретация результатов исследования.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

ADDITIONAL INFORMATION

Study funding. The study was funded by the state assignment (№122020100107-2).

Conflict of Interest. The authors declare that there are no obvious or potential conflicts of interest associated with the content of this article.

Contribution of individual authors. L.T. Volova – initiated and managed the study; was responsible for manuscript editing. E.I. Pugachev – conducted experimental studies; provided detailed analysis of study results. T.V. Starikova – conducted experimental studies. P.A. Lebedev – managed theoretical and clinical part of the study; provided interpretation of study results. I.A. Shafieva – coordinated the laboratory material collection. S.I. Kuznetsov – coordinated the laboratory material collection. O.A. Gusyakova – managed the laboratory tests. G.N. Svetlova – coordinated the study. N.K. Osina – was responsible for study design; provided interpretation of study results.

All authors gave their final approval of the manuscript for submission, and agreed to be accountable for all aspects of the work, implying proper study and resolution of issues related to the accuracy or integrity of any part of the work.

Об авторах

Лариса Т. Волова

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: l.t.volova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-8510-3118

д-р мед. наук, профессор, директор НИИ «БиоТех»

Россия, 443001, Самара, ул. Арцыбушевская, 171

Евгений И. Пугачев

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: evgenesius@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3594-0874

научный сотрудник НИИ «БиоТех»

Россия, 443001, Самара, ул. Арцыбушевская, 171

Татьяна В. Старикова

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: t.v.starikova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-3811-3807

главный специалист НИИ «БиоТех»

Россия, 443001, Самара, ул. Арцыбушевская, 171

Петр А. Лебедев

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: p.a.lebedev@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-1404-7099

д-р мед. наук, профессор, заведующий кафедрой терапии с курсом функциональной диагностики ИПО

Россия, 443001, Самара, ул. Арцыбушевская, 171

Ирина А. Шафиева

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: i.a.shafieva@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-0475-8391

канд. мед. наук, заведующая отделением эндокринологии и ревматологии

Россия, 443001, Самара, ул. Арцыбушевская, 171

Сергей И. Кузнецов

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: s.i.kuznecov@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4302-8946

канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник НИИ «БиоТех»

Россия, 443001, Самара, ул. Арцыбушевская, 171

Оксана А. Гусякова

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: o.a.gusyakova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8140-4135

д-р мед. наук, заведующая кафедрой фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой

Россия, 443001, Самара, ул. Арцыбушевская, 171

Галина Н. Светлова

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: g.n.svetlova@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-9400-8609

канд. мед. наук, доцент кафедры факультетской терапии

Россия, 443001, Самара, ул. Арцыбушевская, 171

Наталья Константиновна Осина

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: n.k.osina@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-0444-8174

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник НИИ «БиоТех»

Россия, 443001, Самара, ул. Арцыбушевская, 171

Список литературы

Дополнительные файлы