Том 58, № 4 (2024)

Современные технологии генной инженерии, такие как редакторы оснований и праймированное редактирование, зарекомендовали себя как эффективные и надежные инструменты редактирования геномов, которые не требуют внесения двухцепочечных разрывов в молекулу ДНК и наличия донорских матриц. Появившись относительно недавно, эти технологии получили быстрое признание благодаря своей точности, простоте и возможностям мультиплексирования. В представленном обзоре суммированы новые данные об этих технологиях, их архитектуре и методах конструирования редакторов, специфичности, эффективности, универсальности. Обсуждаются преимущества, недостатки и перспективы использования редакторов в фундаментальных и прикладных исследованиях. Сведения, приведенные в обзоре, могут быть востребованы для планирования исследований по геномному редактированию и анализа их результатов в ходе решения различных задач фундаментальной биологии, биотехнологии, медицины и сельского хозяйства.

Белки E6 и E7 вируса папилломы человека (ВПЧ) играют ключевую роль в онкогенезе папилломавирусной инфекции. Данные по изменчивости этих онкобелков ограничены, а факторы, влияющие на их изменчивость, малоизучены. Нами проанализирована вариабельность известных к настоящему времени последовательностей белков E6 и E7 ВПЧ типа 16 (ВПЧ16) с учетом их географического происхождения и года cбора образцов, а также направления их эволюции в основных географических регионах мира. Из базы данных GenBank NCBI 6 октября 2022 года были выгружены все последовательности, относящиеся к фрагментам генома ВПЧ16, кодирующим онкобелки E6 и E7. Образцы отфильтровали по следующим параметрам: последовательность включает хотя бы одну из двух интересующих рамок считывания целиком, известны дата сбора и страна происхождения. Всего отобрали 3 651 полногеномную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок E6, и 4 578 полногеномных нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок E7. Полученные после выборки и выравнивания нуклеотидные последовательности переводили в аминокислотные и анализировали с применением программ MEGA11, R, RStudio, Jmodeltest 2.1.20, BEAST v1.10.4, Fastcov и Biostrings. Наибольшая изменчивость первичной структуры белка E6 зарегистрирована в позициях 17, 21, 32, 85 и 90 а. о., а для E7 ‒ в позициях 28, 29, 51 и 77 а. о. Выборка разделилась по географическому признаку на 5 гетерогенных групп: африканскую, европейскую, американскую, регион Юго-Западной и Южной Азии и регион Юго-Восточной Азии. Для ряда стран были выявлены уникальные аминокислотные замены (АК-замены) в белках E6/E7 ВПЧ16, предположительно, характерные для отдельных этнических групп. В основном они локализуются в сайтах известных В- и Т-клеточных эпитопов и относительно редко в структурно-функциональных доменах. Выявленные различия в АК-заменах у различных этнических групп и их колокализация с кластерами B- и T-клеточных эпитопов позволяют предположить их возможную взаимосвязь с географическим распределением аллелей и гаплотипов главного комплекса гистосовместимости (HLA). Это может приводить к распознаванию различного набора В- и Т-клеточных эпитопов вируса, что обусловливает региональные различия в направлении эпитопного дрейфа. В результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок E6 ВПЧ16, выявлен общий предок, подтверждена региональная кластеризация последовательностей гена белка E6 по набору наиболее распространенных АК-замен, а также обнаружены случаи реверсии отдельных АК-замен при изменении региона распространения вируса. Для белка E7 аналогичный анализ был невозможен из-за высокой гомологии последовательностей. Ковариационный анализ совокупной выборки выявил отсутствие взаимосвязи между аминокислотными остатками в белке E6, в белке E7, а также между E6 и E7. Полученные в работе данные важны для разработки терапевтических вакцин против ВПЧ высокого канцерогенного риска.

Низкая эффективность нокина генетических конструкций, особенно в первичных клетках человека, ограничивает применение технологии редактирования генома для терапевтических целей. Таким образом, остается актуальным поиск способов повышения нокина. В представленной работе на модели нокина конструкции, кодирующей пептидный ингибитор слияния ВИЧ-1 MT-C34, в локус CXCR4 человека в Т-клеточной линии CEM/R5 изучены возможности нескольких подходов к повышению эффективности этой технологии. В первую очередь оценена модификация донорной ДНК как способа повышения эффективности транспорта плазмид в ядро, а именно: введение в донорную плазмиду последовательностей DTS (DNA transporting sequence) вируса-40 обезьян (SV40) или сайтов связывания транскрипционного фактора NF-κB, влияние которых на уровень нокина было неизвестно. На использованной нами модели нокина в локус CXCR4 такая модификация оказалась неэффективной. Второй подход, заключавшийся в модификации нуклеазы Cas9 путем введения двух дополнительных сигналов ядерной локализации (NLS), позволил повысить уровень нокина на 30%. Наконец, блокировка репарации ДНК по пути негомологичного соединения концов с помощью ингибиторов ДНК-зависимой протеинкиназы вызывала повышение нокина в 1.8 раз. Комбинация двух последних подходов давала аддитивный эффект. Таким образом, с помощью увеличения числа NLS в белке Cas9 и ингибирования репарации ДНК по пути негомологичного соединения концов нам удалось значительно повысить уровень нокина конструкции, кодирующей пептидный ингибитор слияния ВИЧ-1, в клинически релевантный локус CXCR4, что может быть использовано для разработки эффективных генотерапевтических подходов к лечению ВИЧ-инфекции.

Чувствительность клеток глиобластомы человека к вирус-опосредованному онколизу изучена на пяти линиях клеток, полученных от пациентов. Первичные клетки глиобластомы (Gbl13n, Gbl16n, Gbl17n, Gbl25n и Gbl27n) инфицировали 10-кратными серийными разведениями вируса паротита (штамм Ленинград-3), репродукцию вируса и цитотоксичность отслеживали в течение 96–120 ч. Иммортализованные неопухолевые клетки NKE человека использовали в качестве контроля для определения специфичности вируса. Четыре из пяти клеточных линий глиобластомы были чувствительны к заражению вирусом паротита, тогда как в неопухолевой линии клеток репродукцию вируса не наблюдали. При этом уровень активности проапоптотической каспазы-3 повышался во всех инфицированных клетках через 48 ч после заражения. Кинетика накопления вирусной РНК в исследованных линиях клеток глиобластомы была сопоставимой со скоростью гибели клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что клеточные линии глиобластомы пермиссивны для вируса паротита. Продукция интерферона типа I в ответ на заражение вирусом паротита клеточных линий глиобластомы различалась. Кроме того, показано, что заражение вирусом паротита способно вызывать иммуногенную гибель клеток глиобластомы.

Ряд белков с доменами типа цинковых пальцев, включая Aef1 и CG10543, взаимодействуют, как показано нами ранее, с DUB-модулем комплекса SAGA дрозофилы. В представленной работе проведено полногеномное исследование локализации белков Aef1 и CG10543 и показано, что они находятся преимущественно на промоторах активных генов. Сайты связывания этих белков колокализуются с комплексами модификации и ремоделирования хроматина SAGA и dSWI/SNF, а также с репликационным комплексом ORC. Показано, что белки Aef1 и CG10543 участвуют в регуляции экспрессии части генов, на промоторах которых они находятся. Таким образом, белки Aef1 и CG10543 являются новыми участниками транскрипционной сети клетки, которые колокализуются с основными транскрипционными и репликационными комплексами дрозофилы.

Ожирение ассоциировано с изменением состава кишечной микробиоты, а также с увеличением проницаемости кишечной стенки. У 130 здоровых волонтеров, 57 пациентов с метаболически здоровым ожирением (МЗО) и 76 пациентов с метаболически нездоровым ожирением (МНЗО) из образцов фекалий выделяли бактериальную ДНК с дальнейшим секвенированием гена 16S рРНК. Метаболический профиль микробиоты, предсказанный с использованием программного обеспечения PICRUSt2 (https://huttenhower.sph.harvard.edu/picrust/), был более изменен у пациентов с МНЗО, чем с МЗО. Ожирение, особенно МНЗО, сопровождалось увеличением способности кишечной микробиоты к катаболизму энергетических субстратов и продукции энергии в общих путях катаболизма, синтезу водорастворимых витаминов (В1, В6, В7), нуклеотидов, гема, ароматических аминокислот и ряда защитных структурных компонентов клеток. Подобные изменения могут быть следствием адаптации микробиоты к условиям, специфическим для МНЗО. По-видимому, таким образом формируется порочный круг, когда МНЗО способствуют истощению кишечного микробиома, а дальнейшее перерождение последнего вносит вклад в патогенез формирования метаболических нарушений. В сыворотке крови участников исследования определяли концентрацию трефоиловых факторов, которая может отражать состояние мукозального барьера. У пациентов с МЗО и МНЗО было повышено содержание трефоиловых факторов 2 и 3 типов, но значимых ассоциаций их уровня с метаболическим профилем кишечной микробиоты не зарегистрировано.

Предложены молекулы, блокирующие функциональный цикл вирусов гриппа А и SARS-CoV-2. Молекулы-блокаторы, эффективно связывающиеся в каналах М2 и Е вирусов гриппа А и SARS-CoV-2 и блокирующие диффузию ионов H⁺/K⁺, разрушают жизненный цикл вирусов. Предложено семейство положительно заряженных, +2 e. u., молекул-блокаторов диффузии ионов H⁺/K⁺ через М2- и Е-каналы. Изучено сродство молекул-блокаторов, производных диазабициклооктана, к связыванию белков каналов М2 и Е. Проведено моделирование тепловой динамики нативных и мутантных структур каналов и связывание молекул-блокаторов методом исчерпывающего докинга. Расчеты энергии связывания показали, что белки М2- и Е-каналов имеют внутриканальные, блокирующие и внеканальные сайты связывания. Предложены молекулы-блокаторы с преимущественным сродством к блокирующим модам связывания. Рассмотрены наиболее вероятные мутации аминокислот белка М2 и E каналов, проанализирована эффективность блокирования каналов и предложены оптимальные структуры молекул-блокаторов.